[发明专利]一种结直肠癌实体瘤原代细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种结直肠癌原代细胞的培养方法。本发明提供了一种结直肠癌实体瘤原代细胞培养方法及配套试剂，该技术的核心是：(1)用温和细胞解离试剂处理结直肠癌实体瘤组织，最大程度的保证了组织中癌细胞的活力；(2)配制特殊的无血清培养基，利用悬浮培养体系对结直肠癌实体瘤来源的肿瘤细胞进行体外培养，保证癌细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。利用本发明方法得到的结直肠癌原代细胞培养物可以用于多种细胞水平的体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可以预见，这种培养方法在结直肠癌的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种结直肠癌实体瘤原代细胞的培养方法。

背景技术

结直肠癌是最常见的严重威胁人类的健康恶性肿瘤之一。在我国结直肠癌的发病率为9.24％，在所有恶性肿瘤中占第四位。而结直肠癌的死亡率为11.77％，在全部恶性肿瘤中占第五位。随着经济的发展、生活水平的提高和生活方式的改变，结直肠癌的发病率还将呈不断上升的趋势。另外，结直肠癌复发转移风险高，超过50％的结直肠癌患者会在根治性治疗后数月到数年内出现不同程度的复发转移。

尽管世界各国的科研和医疗机构对结直肠癌的病因以及发生发展过程的研究都有很大力度的投入，但是人类对这种疾病仍然知之甚少。结直肠癌是一种复杂疾病，其发生、发展是一个动态的过程，涉及到诸多信号分子相互作用，形成了一个复杂的分子调控网络，同时还受到外界环境因素的影响。结直肠癌的病因和发生发展过程有很强的个体差异性，不能一概而论。因此将结直肠癌实体瘤原代细胞培养物作为模型进行个体化精准研究是结直肠癌研究领域乃至结直肠癌诊断治疗领域的趋势。

现有的原代肿瘤细胞培养技术主要有2D培养，3D培养，重编程培养等几类，这些方法都不同程度的面临培养周期极长，培养成功率低，杂细胞难以去除等问题。

发明内容

为了有效解决上述技术问题，本发明提供了一种新的结直肠癌实体瘤原代细胞培养技术及配套试剂，该技术的核心是：(1)用温和细胞解离试剂处理结直肠癌实体瘤组织，最大程度的保证了组织中癌细胞的活力；(2)配制特殊的无血清培养基，利用悬浮培养体系对结直肠癌实体瘤来源的肿瘤细胞进行体外培养，保证癌细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。

第一方面，本发明要求保护一种培养结直肠癌实体瘤原代细胞的方法。

本发明所提供的培养结直肠癌实体瘤原代细胞的方法，具体可包括如下步骤：

(1)用样本解离液对结直肠癌实体瘤组织进行解离处理，获得结直肠癌实体瘤原代细胞；

所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶II、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；所述胶原酶II在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；所述胶原酶IV在所述样本解离液中的终浓度为50-150U/mL(如100U/mL)；余量均为PBS。

其中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶II或所述胶原酶IV)的单位U：在37℃，pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶II或所述胶原酶IV)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。

在本发明的具体实施例中，所述胶原酶I的品牌货号为Gibco#17100-017；所述胶原酶II的品牌货号为Gibco#17101-015；所述胶原酶IV的品牌货号为Gibco#17104-019；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。

(2)利用结直肠癌实体瘤原代细胞培养基悬浮培养步骤(1)解离出来的结直肠癌实体瘤原代细胞；