[发明专利]一种结直肠癌实体瘤原代细胞的培养方法

权利要求书

1.一种培养结直肠癌实体瘤原代细胞的方法，包括如下步骤：

(1)用样本解离液对结直肠癌实体瘤组织进行解离处理，获得结直肠癌实体瘤原代细胞；

所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶II、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；所述胶原酶II在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；所述胶原酶IV在所述样本解离液中的终浓度为50-150U/mL；余量均为PBS；

(2)利用结直肠癌实体瘤原代细胞培养基悬浮培养步骤(1)解离出来的结直肠癌实体瘤原代细胞；

所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基由所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基由抗菌抗真菌剂三抗、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白Wnt-3a、人重组蛋白Noggin、SB202190、A83-01、Primocin^TM、N-乙酰-L-半胱氨酸、烟碱、N-2Supplement、皮质醇、B27、ITS-X、Y-27632和Advanced DMEM/F12培养基组成；其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为250-250ng/mL；所述HEPES在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为8-12mM；所述GlutaMax在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量)；所述人重组蛋白EGF在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为10-100ng/mL；所述人重组蛋白bFGF在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白HGF在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白Wnt-3a在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为200-300ng/mL；所述人重组蛋白Noggin在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为100-200ng/mL；所述SB202190在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为5-10μM；所述A83-01在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为0.25-1.25μM；所述Primocin^TM在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为1％(体积百分含量)；所述N-乙酰-L-半胱氨酸在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为0.5-2mM；所述烟碱在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为5-10mM；所述N-2Supplement在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为1％(体积百分含量)；所述皮质醇在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为20-50ng/mL；所述B27在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为1.5-2.5％(体积百分含量)；所述ITS-X在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量)；所述Y-27632在所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为5-20μM；余量均为AdvancedDMEM/F12培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，是按照包括如下步骤的方法用所述样本解离液对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离的：按0.1-0.3mL所述样本解离液每mg组织的用量，将剪碎后的所述结直肠癌实体瘤组织用事先37℃预热的所述样本解离液进行处理，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，是按照包括如下步骤的方法用所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述结直肠癌实体瘤原代细胞的：使用具有低吸附表面的培养容器，利用所述结直肠癌实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述结直肠癌实体瘤原代细胞，37℃，5％CO₂条件下进行培养，每2-4天更换一次培养基。