[发明专利]一种蛋白质芯片筛选生物标志方法

说明书

本发明涉及一种蛋白质芯片筛选生物标志方法，其特征在于，包括如下步骤：制备蛋白质芯片、细胞样本预处理、目标蛋白提取、生物标志筛选，本发明改进了基质材料的表面处理技术，可减少蛋白质的非特异性结合；提供了合适的温度和湿度，能够保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体涉及一种蛋白质芯片筛选生物标志方法。

背景技术

生物芯片最初由美国公司开发，之后芯片技术发展十分迅速，呈现出高度平行性、多样性、微型化和自动化的特点。蛋白质肤芯片为生物芯片的一种，研究对象是蛋白质，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列。体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供了有力的技术支持，蛋白质芯片能够同时检测生物样品中与某种疾病或者环境因素损伤可能相关的全部蛋白质的含量情况，在医学领域中有着潜在的广阔应用前景。

目前，蛋白检测芯片技术存在以下问题：蛋白芯片的基础是抗原抗体亲和反应，特异性及亲和力有限；不同的蛋白质在临床样品中的丰度不同，抗体抗原反应的亲和力不同，因此，寻找适合蛋白质固定的基底材料，以及高效固定蛋白的方法成为该领域迫切的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了了一种蛋白质芯片筛选生物标志方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、制备蛋白质芯片

蛋白质芯片包括载玻片、中间层和探测层，制备蛋白质芯片的具体步骤如下：

a.选择一块载玻片，载玻片为正方形，厚度为2-5mm，尺寸为6mm×6mm，将其置入30％的过氧化氢中浸泡20-30分钟，再用去离子水冲洗干净，在50-60℃条件下烘干待用；

b.将步骤a处理好的载玻片浸入到100ml25％为巯基乙酸溶液中，20-30℃条件下浸泡30分钟，可得到中间层；

c.将步骤b处理好的载玻片全部浸入到100ml的45％的生物探针中浸泡1-1.5小时，可得到探测层；生物探针为能与目标蛋白结合的抗体；

d.取出步骤c处理好的载玻片用去离子水冲洗干净，可得蛋白质芯片；将生物探针的蛋白质芯片置于50-75℃烘箱中干燥待用；

S2、细胞样本预处理

a.用研钵在-10℃冷冻条件下将细胞样本研成粉末，用4℃的PBS溶液清洗细胞样本2-3次；

b.对每100000个步骤a处理后的细胞样本，加入0.5ml裂解液，裂解20-30分钟，将细胞样本裂解液收集到EP管中，加入10ml细胞样本蛋白提取缓冲液，使用细胞匀浆器匀浆30s；

以重量百分比计，裂解液包括0.05-0.1％的氯化铵、0.05-0.1％的氯化钠、0.1-1.5％的EDTA、0.005-0.01％的过氧化氢、0.02-0.1％TritoAx-100和0.05-0.2％目标蛋白分解酶；余下部分为去离子水；

以重量百分比计，细胞样本蛋白提取缓冲液包括0.01-0.15％的Tris、0.01-0.1％的氯化钠、0.05-0.5％的AP40、0.05-0.2％的Aproti，余下部分为去离子水；

c.将步骤b处理好细胞悬液置于4℃下，以3000rpB转速离心5分钟；放置3-4分钟，直至细胞悬液变清，避开上层漂浮的脂质层，取上清液，得到细胞样本预处理液；

S3、目标蛋白提取