[发明专利]一种蛋白质芯片筛选生物标志方法

权利要求书

1.一种蛋白质芯片筛选生物标志方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、制备蛋白质芯片

所述蛋白质芯片包括载玻片、中间层和探测层，制备所述蛋白质芯片的具体步骤如下：

a.选择一块所述载玻片，所述载玻片为正方形，厚度为2-5mm，尺寸为6mm×6mm，将其置入30％的过氧化氢中浸泡20-30分钟，再用去离子水冲洗干净，在50-60℃条件下烘干待用；

b.将步骤a处理好的所述载玻片浸入到100ml 25％的巯基乙酸溶液中，20-30℃条件下浸泡30分钟，可得到所述中间层；

c.将步骤b处理好的所述载玻片全部浸入到100ml的45％的生物探针中浸泡1-1.5小时，可得到所述探测层；所述生物探针为能与目标蛋白结合的抗体；

d.取出步骤c处理好的所述载玻片用去离子水冲洗干净，可得所述蛋白质芯片；将所述含有生物探针的蛋白质芯片置于50-75℃烘箱中干燥待用；

S2、细胞样本预处理

a.用研钵在-10℃冷冻条件下将细胞样本研成粉末，用4℃的PBS溶液清洗所述细胞样本2-3次；

b.对每100000个步骤a处理后的所述细胞样本，加入0.5ml裂解液，裂解20-30分钟，将细胞样本裂解液收集到EP管中，加入10ml细胞样本蛋白提取缓冲液，使用细胞匀浆器匀浆30s；

以重量百分比计，所述裂解液包括0.05-0.1％的氯化铵、0.05-0.1％的氯化钠、0.1-1.5％的EDTA、0.005-0.01％的过氧化氢、0.02-0.1％Triton x-100和0.05-0.2％目标蛋白分解酶；余下部分为去离子水；

以重量百分比计，所述细胞样本蛋白提取缓冲液包括0.01-0.15％的Tris、0.01-0.1％的氯化钠、0.05-0.5％的NP-40、0.05-0.2％的Aprotinin，余下部分为去离子水；

c.将步骤b处理好细胞悬液置于4℃，以3000rpB转速离心5分钟；放置3-4分钟，直至所述细胞悬液变清，避开上层漂浮的脂质层，取上清液，得到细胞样本预处理液；

S3、目标蛋白提取

a.取50ml所述细胞样本预处理液置于EP管中，并放入一块蛋白质芯片，置于4℃条件下3-5小时，让目标组蛋白与所述蛋白质芯片上的所述生物探针结合；

b.对应每100000个所述细胞样本，在装有所述细胞样本裂解液的EP管中，加入20μl100mM氯化钠溶液，轻轻重悬所述蛋白质芯片上的所述生物探针；

c.40-50℃水浴加热10分钟后，将所述EP管放在磁力架上，去除上清，用200ul 4℃的0.5mM EDTA溶液洗涤1-2次，用200ul 350mM氯化钠溶液洗涤2-3次，用200ul 50mM Tris-HCl溶液洗涤2-3次，以上洗涤每次10-15分钟；

d.加50ul洗脱缓冲液在37℃洗脱30分钟，转上清至新的离心管中加2.5ug目标蛋白分解酶，在50-75℃条件下解交联过夜；再用150ul所述洗脱缓冲液在37℃洗脱所述蛋白质芯片上的所述生物探针20-30分钟，溶出所述目标蛋白；

以重量百分比计，所述洗脱缓冲液包括5-15％的氯化镁、10-20％的氯化钠、20-25％的乙二醇、0.001-0.01％的硫氰酸钠和0.5-0.2％SDS；余下部分为去离子水；

S4、生物标志筛选

通过质谱分析和等离子共振对所述蛋白质芯片进行检测，提取目标蛋白的功能注释条目，分析所述目标蛋白集中度；常采用基于超几何分布的假设检验方法，其计算方法如公式一所示：

公式一：

如果R1，则所述目标蛋白相对集中，通过公式二计算相应的疾病相关蛋白质与非疾病相关蛋白的差值r：

公式二：

如果R1，则所述目标蛋白相对分散，通过公式三计算相应的疾病相关蛋白质与非疾病相关蛋白的差值r：

公式三：

其中，R表示标准数据库中疾病相关蛋白在所述目标蛋白的注释条目中的集中度；A为蛋白质数据库中存储的所有蛋白质的数目，a为所述蛋白质数据库中所述目标蛋白的数目；B为疾病相关标准数据库中存储的蛋白质的数目，b为疾病相关标准数据库所述目标蛋白的数目，i为小于或等于a的正整数；

r为相应的疾病相关蛋白质与非疾病相关蛋白的差值，通过限定其分布，可筛选出与疾病相关的注释条目。