[发明专利]一种热稳定性改良的低温外切菊粉酶突变体Mut8S

说明书

本发明涉及基因工程及蛋白质改造技术领域，具体来说是一种热稳定性改良的低温外切菊粉酶突变体Mut8S，突变体Mut8S的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。Mut8S的最适pH为6.5；最适温度为40℃，在0℃、10℃、20℃、30℃和50℃时分别具有16％、27％、51％、76％和78％的酶活；50℃处理60min后，Mut8S仍然保持100％的酶活；该酶可水解菊粉产生果糖。本发明的热稳定性改良的低温外切菊粉酶突变体Mut8S可应用于食品、酿酒和生物能源等行业。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及蛋白质改造技术，具体为一种热稳定性改良的低温外切菊粉酶突变体Mut8S。

背景技术

菊粉，又称菊糖，由果糖分子通过β-2,1糖苷键聚合而成，末端与一分子葡萄糖残基相连，广泛存在于菊芋、牛蒡、菊苣等多种植物中。菊粉酶具有2种作用方式：一种为内切型菊粉酶，水解菊粉多糖链内部的β-2,1糖苷键，生成低聚果糖；另一种为外切型菊粉酶，从非还原端逐个水解β-2,1糖苷键，最终生成果糖和少部分的葡萄糖。菊粉的水解产物即果糖广泛用于食品、医药、生物能源等工业。例如，果糖甜度是蔗糖的1.5–2.0倍，并且热量低、风味好，可作为天然甜味剂替代蔗糖；果糖代谢不受胰岛素的制约，可以供糖尿病患者食用；果糖经酵母等发酵后可以用来生产生物乙醇。因而，外切菊粉酶可应用于食品、酿酒和生物能源等行业中(Singh RS et al.International Journal of BiologicalMacromolecules,2017,96:312–322.)。

酶的生产、保存、运输、应用等常常需要酶具有良好的热稳定性。低温酶可应用于低温环境要求下的生物技术领域，低温下的处理(如果汁澄清)可防止微生物的污染、营养损失和食品品质降低，还可起到降低能耗的作用(Cavicchioli et al.MicrobialBiotechnology,2011,4(4):449–460.)。因此，低温外切菊粉酶可用于酒的发酵、食品的腌制、去污、低温下的菊粉加工等，具有重要的开发价值。然而，低温酶普遍热稳定性差，需要改良其热稳定性。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种热稳定性改良的低温外切菊粉酶突变体Mut8S，可应用于食品、酿酒和生物能源等行业。

为了实现该技术目标，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种热稳定性改良的低温外切菊粉酶突变体Mut8S，所述的突变体Mut8S的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。与GenBank记录的外切菊粉酶序列AGC01503(SEQ ID No.3)相比：Mut8S不含有位于AGC01503的N端的信号肽序列“MIKLKKYGVLMLLLGVFGTSLA”；Mut8S含AGC01503的八点突变，包括AGC01503的第61位氨基酸N突变为E、第156位氨基酸K突变为R、第236为氨基酸P突变为E、第243位氨基酸T突变为K、第268位氨基酸D突变为E、第277位氨基酸T突变为D、第390位氨基酸Q突变为K、第409位氨基酸R突变为D；在N末端，Mut8S比AGC01503多了氨基酸“GP”。

所述突变体Mut8S的最适pH为6.5；最适温度为40℃，在0℃、10℃、20℃、30℃和50℃时分别具有16％、27％、51％、76％和78％的酶活；50℃处理60min后，Mut8S仍然保持100％的酶活；该酶可水解菊粉产生果糖。

本发明提供了所述的热稳定性改良的低温外切菊粉酶突变体Mut8S编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的在于提供一种包含热稳定性改良的低温外切菊粉酶突变体Mut8S编码基因的重组载体。

本发明的另一目的在于提供一种包含热稳定性改良的低温外切菊粉酶突变体Mut8S编码基因的重组菌。

另外，本发明所述的外切菊粉酶突变体Mut8S在食品及酿酒制备中的应用也在本发明的保护范围内。