[发明专利]柑橘鳞皮病毒的RT-LAMP检测试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种柑橘鳞皮病毒的RT‑LAMP检测试剂盒，包括引物对F3‑5/B3‑5和FIP3‑5/BIP3‑5，序列为：F3‑5:5’‑CTTTGAGTCCATCAACTGTT‑3’，B3‑5:5’‑TCACTCTGAAGCTGACAT‑3’，FIP‑5:5’‑GGTGAAGGACCAACTAGGACGTTGCTGAAATCTGCCTC‑3’,BIP‑5:5’‑GAAACCCCTTGTTCTTGTCGGGTGCTATAATTTACAGCCTCA‑3’。还公开了柑橘鳞皮病毒的RT‑LAMP检测方法，提取样品总RNA，利用前述试剂盒进行RT‑LAMP扩增，58～68℃扩增40～80min。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种柑橘鳞皮病毒的RT-LAMP检测试剂盒和方法。

背景技术

柑橘鳞皮病毒(Citrus psorosis virus，CPsV)是一种对柑橘具有毁灭性的病害，该病自20世纪90年代在美国佛罗里达州和加利福尼亚州被首次发现以来，相继在阿根廷、西班牙、埃及、意大利等国家广泛发生(Roistacher，1993)。柑橘鳞皮病主要危害甜橙、葡萄柚和宽皮柑橘，可引起寄主主干和大枝典型的树皮鳞片状开裂症状，并伴随木质部导管充胶变色，感染该病毒的树木产量只有健康树木产量的28％(Achachi et al.，2014)。柑橘鳞皮病主要通过嫁接进行传播(Martín et al.，2002)，卵菌亚纲的油壶菌也可以传播CPsV(Palle et al.，2005；Vaira et al.，2007,2009)。柑橘鳞皮病有鳞皮病A(PsA)和鳞皮病B(PsB)两种类型，其中以PsA最为常见。PsA可引起植株主干树皮鳞片化开裂，木质部导管充胶变色。PsB的危害比PsA严重，主要引起嫰枝充胶，树皮大面积开裂，老叶上形成变色环斑，有时沿叶脉可见褪绿斑纹(Velázque et al.，2012)，10-20树龄的树木较易出现树皮鳞皮状开裂(Achachi et al.，2014)。

在田间样品大规模检测过程中发现我国田间有该病毒的分布，而目前关于CPsV的检测主要是通过ELISA、分子杂交，RT-PCR和免疫电镜等方法(Martín et al.，2004；Achachi et al.，2015)，其中RT-PCR的方法需要昂贵的检测仪器，且灵敏度需要进一步的提高；ELISA、分子杂交和免疫电镜的方法操作费事，且灵敏度低。环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是采用4条特异引物和DNA链置换聚合酶(Bst DNApolymerase)在恒温条件下建立的一种新型的分子检测技术(Notomi etal.,2000)，现已广泛的应用于各种病原微生物的检测(Okuda et al.，2015；Rudolph etal.，2015；Warghane et al.，2017；Lu et al.，2018)。

发明内容

针对上述技术问题，本发明旨在提供一种简单、方便、快捷、灵敏度高的柑橘鳞皮病毒的RT-LAMP检测试剂盒和方法。

为此，本发明所采用的技术方案为：

一种柑橘鳞皮病毒的RT-LAMP检测试剂盒，包括外引物对F3-5/B3-5和内引物对FIP3-5/BIP3-5，所述内、外引物对的序列为：

F3-5:5’-CTTTGAGTCCATCAACTGTT-3’，

B3-5:5’-TCACTCTGAAGCTGACAT-3’，

FIP-5:5’-GGTGAAGGACCAACTAGGACGTTGCTGAAATCTGCCTC-3’，

BIP-5:5’-GAAACCCCTTGTTCTTGTCGGGTGCTATAATTTACAGCCTCA-3’。

在上述技术方案中，还包括LAMP Kit。