[发明专利]一种重组小RNA的生产方法及应用

说明书

本发明公开了一种重组小RNA的生产方法，该方法以tRNA为支架，嵌合miRNA前体，在大肠杆菌中表达目标小RNA。另外，本发明还公开了采用该方法生产的重组小RNA的应用。本发明设计制备的重组小RNA为通过生物工程技术获得，具有设备简便、生产快速、产量高、成本低、功能性好等优势；经多种技术手段检测表明，本发明的方法能方便快捷地制备多种miRNA/siRNA/RNA适配体，生产制备的重组小RNA满足科学研究及药物研发的需求。

技术领域

本发明属于分子生物学及医学技术领域，具体涉及一种重组小RNA的生产方法及应用。

背景技术

非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)在生物学相关领域的研究和疾病治疗中有着广阔的应用前景。在过去的二十年中，小ncRNA作为基因调控的关键表观遗传因素已经得到了充分的证实。这些小ncRNA主要是通过RNAi途径参与沉默复合物(RISC)的形成，从而诱导基因的沉默。对ncRNA功能的研究，催生了新型治疗方法，即RNA疗法的诞生。例如，重建抑癌miRNA水平可显著减慢肿瘤疾病进程。

然而，ncRNA的功能、药理活性及治疗学研究依赖于相关RNA原料的获取。目前RNA原料主要通过化学合成或利用重组DNA质粒，在细胞中表达相应RNA的方法获取。这些方法合成的小RNA，不仅价格昂贵，而且为了提高其稳定性可能带有过多的人工基团修饰，或缺少必要的的转录后修饰。因此，小RNA的折叠、生物活性及安全性都可能受到影响。例如，化学法合成小RNA通常会对其磷酸骨架中的氧原子进行硫取代，或对核糖基中的基团进行修饰(2'-O-甲基修饰、2'-O-甲氧乙基修饰等)以提高小RNA的代谢活性过对靶分子的亲和力。但是，人工修饰可能引起比较严重的免疫反应。由于不良免疫反应的高发生率，化学合成的miR-34a模拟物的I期临床试验已经被终止，化学合成siRNA药物Revusiran也因为相同的原因被终止了III期临床试验。目前，高昂的成本及生产的RNA原料功能的不确定性使得RNA疗法的发展严重受限。也提示我们，活细胞中产生的ncRNAs可能更好地应用于生物、医学研究以及小核酸药物的开发中，以避免严重免疫反应。

近来，tRNA已被成功地用作支架在大肠杆菌中生产小ncRNA(Luc Ponchon,etal.,Recombinant RNA technology:the tRNA scaffold[J].Nature Methods,2007,4(7):571-576；Luc Ponchon,et al.,A generic protocol for the expression andpurification of recombinant RNA in Escherichia coli using a tRNA scaffold[J].Nature Protocols,2007,4(6):947-959)。Ponchon et.al.的方法是使用甲硫氨酰tRNA和人赖氨酸tRNA直接嵌合小ncRNA前体进行表达，再用RNase H对所表达的重组RNA进行切割之后，用离子交换色谱纯化成熟小ncRNA片段。然而，此种生物表达方法，已被证明其适用范围有限，多种小RNA在该策略下无法表达或表达量过低。加州大学戴维斯分校Ai-Ming Yu等人发明了用大肠杆菌甲硫氨酰tRNA嵌合前体microRNA表达短片段RNA的方法(WO2015183667A1)。Yu et.al.的方法较Luc Ponchon,et.al.方法普适性更强。以tRNA直接嵌合前体小RNA无法表达的多个小RNA，使用Yu et.al.的方法均可表达。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种重组小RNA的生产方法。该方法以人丝氨酸tRNA嵌合hsa-miR-34a前体，人丝氨酸tRNA为人源tRNA，用其作为支架生产的重组小RNA的开发前景更好，因为人体细胞中本身含有丝氨酸tRNA，但无细菌来源的甲硫氨酰tRNA，因此用人丝氨酸tRNA为支架其毒性及免疫原性均可能更低；本发明缩短了所表达的重组tRNA的长度，从而降低了细胞毒性，提高了表达量；本发明对hsa-miR-34a前体中的序列进行改造(105ΔG)，改善互补配对情况，形成更完美的“茎”，提高重组小RNA稳定性。