[发明专利]一种重组小RNA的生产方法及应用

权利要求书

1.一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，以tRNA为支架，嵌合miRNA前体，在大肠杆菌中表达目标小RNA；

所述tRNA为人丝氨酸tRNA，其序列如下：

nnngcagcga uggccgagug guuaaggcgu uggacunnnn nnnnnnnnnn 50

nnaauccaau ggggucuccc cgcgcagguu cgaacccugc ucgcugcgcc 100

annn 104；

所述miRNA为优化后的hsa-miR-34a前体，其序列如下：

ggccagcugu gaguguuucu uuggcagugu cuuagcuggu uguugugagc 50

aauaguaagg aagcaaucag caaguauacu gcccuagaag ugcugcacgu 100

uguuggccc 109；

所述miRNA前体嵌合于tRNA反密码子环处，得到的嵌合序列如下：

nnngcagcga uggccgagug guuaaggcgu uggacuggcc agcugugagu 50

guuucuuugg cagugucuua gcugguuguu gugagcaaua guaaggaagc 100

aaucagcaag uauacugccc uagaagugcu gcacguuguu ggcccaaucc 150

aauggggucu ccccgcgcag guucgaaccc ugcucgcugc gccannn 197。

2.根据权利要求1所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述小RNA为长度小于400nt的RNA。

3.根据权利要求1所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述小RNA的生产方法包括以下步骤：

步骤一、设计合成miR-34a前体引物；

步骤二、利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点，将hsa-miR-34a前体的表达序列插入pBSMrnaSeph质粒中，构建表达载体；

步骤三、将构建的表达载体中miR-34a的成熟序列部分替换为目标小RNA序列，构建嵌合目标序列的表达载体；

步骤四、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌；

步骤五、大肠杆菌培养扩增后，提取菌内总RNA，以FPLC分离纯化目标小RNA。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述小RNA为shRNA、miRNA、siRNA或RNA适配体。

5.根据权利要求3所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，步骤四中所述大肠杆菌为HST08菌株。

6.根据权利要求3所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，步骤五中大肠杆菌采用LB培养基或2XYT培养基培养。