[发明专利]检测副溶血性弧菌的RPA引物、探针、试剂盒和方法

说明书

本发明提供检测副溶血性弧菌的RPA引物、探针、试剂盒和方法。本发明检测副溶血性弧菌的RPA引物包括针对irgb基因的上游引物Seq ID No.1和下游引物Seq ID No.2。相对于现有技术，本发明的试剂盒及检测方法，可快速检测样品中是否存在副溶血性弧菌核酸。操作简单，无需特殊昂贵的仪器，在疾病监测、临床诊断和食品安全监测等领域具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测副溶血性弧菌的RPA引物和探针、试剂盒及RPA等温快速检测方法。

背景技术

副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus,Vp) 是一种革兰氏阴性嗜盐菌，属弧菌科弧菌属，是最重要的食源性致病菌之一，它广泛分布于近海区域、鱼、贝类等海产品以及腌制食品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌，可以导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐和头疼等典型胃肠炎反应，严重者可以引起败血症。国家食源性疾病监测网数据显示，副溶血弧菌引起的食物中毒在发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经高居微生物性食物中毒之首，因此，开发副溶血性弧菌的快速检测方法对该菌的预防和检测非常重要。

目前副溶血性弧菌的检测方法主要是传统培养方法和PCR方法。虽然传统培养方法对实验设备的要求不高，但是检测的周期较长，操作繁琐，需要分离获得纯培养物后进行嗜盐实验等系列生化鉴定实验，检测效率低，无法满足当前检测工作中对样品进行快速检测的要求。而随着分子生物学检测技术的发展，PCR检测方法也随之而出现，但PCR方法在于扩增反应受多种因素的影响，需要投入比较昂贵的仪器，易出现非特异性扩增，检测时间相对较长。这些方法均不利于现场快速检测。为确保食品安全的快速发展，急需有关副溶血性弧菌的快速检测方法。

重组酶聚合酶等温扩增技术( recombinase polymerase amplification, RPA)是近年发展起来的一种新型的等温扩增技术，其原理是在恒温下，重组酶与寡核苷酸引物结合，形成酶和引物的复合体，酶促使引物定位到DNA 双链模板的同源靶序列上，并在单链DNA 结合蛋白的协助下，解链模板DNA，随后在DNA 聚合酶的作用下，形成新的DNA 互补链。该方法的主要特点在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。目前RPA技术已经应用到病毒、细菌、支原体、寄生虫等的快速检测中，然而目前并没有被应用于副溶血性弧菌的检测应用中。而对于RPA方法来说，引物探针的特异性是其检测特异性和灵敏性的基础。

irgb为铁调节毒力监管蛋白基因，是2010新报道的副溶血性弧菌的特有的分子标记基因，相比于tlh，toxR，gyrb，pR72H等基因更具特异性，与弧菌属的其他非副溶血性弧菌无交叉，特异性强、灵敏度高，适合应用于副溶血性弧菌的分子检测。

发明内容

为了解决上述提及的副溶血性弧菌检测时效和特异性问题，本发明提供一种方便快速的检测副溶血性弧菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法。

一种检测副溶血性弧菌的RPA引物，针对irgb基因包括

上游引物Seq ID No.1: 5’- CGCCAAACTACATCGGAAAACATGGCCCCATC -3’和下游引物Seq ID No.2：5’- CTAGAAAAAACTCCCCTTGTTCTGGGTGCGAG -3’。

优选的，所述下游引物Seq ID No.2在5’端进行biotin修饰。

一种检测副溶血性弧菌的RPA引物，采用所述的引物中的上游引物、下游引物中的至少一种，或选自所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。