[发明专利]一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针及方法与应用

说明书

本发明公开了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT‑PCR引物和探针及方法与应用，该引物和探针的序列如SEQ ID NO:1～3所示。本发明可快速、特异、灵敏地检测猪非典型瘟病毒，最低检测浓度为5copies/μL。本发明使用的操作方法简单、反应结果易于判断，灵敏性和检出率高，并且能够避免假阳性现象，适用于疾病监测、现场应急及临床样品的检测，适合大范围推广应用。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体地说，涉及一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针及方法与应用。

背景技术

猪非典型瘟病毒(Atypical porcine pestivirus，APPV)是近几年来新发现的一种新型瘟病毒，与猪瘟(Classical swine fever virus，CSFV)、牛病毒性腹泻(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)、边境瘟病毒(Border disease virus，BDV)等同属瘟病毒属(Pestivirus)黄病毒科(Flaviviridae)。其发病特征是在出生后数小时内可观察到骨骼肌的双侧痉挛收缩，并造成无法吮乳的现象，严重时可损伤仔猪的脑和脊髓，并导致仔猪死亡。在临床上症状轻重不一，有的仔猪是全身一致的、有节奏的震颤，无法站立，在躺卧后震颤减轻或停止。有的仔猪全身震颤程度不一，仅头部、颈部震颤强烈，不能准确吃奶但仍可正常运动。2015年，美国Hause 研究小组检测并证实了该病毒的存在，同时指出APPV可能导致仔猪先天性震颤。随后，该病毒在德国、荷兰、西班牙、奥地利等地相继被报道。在2017年，该病毒被我国华南农业大学宁永章课题组首次发现。

目前对于猪非典型瘟病毒尚无预防用生物制品，能准确、快捷、有效的检测猪非典型瘟病毒(APPV)对于提高对该病毒的防控是至关重要的。目前，根据研究数据表明，该病毒的基因序列变异快，不同毒株之间基因序列差异大，国外建立的检测方法在国内并不适用，而国内已有的普通PCR和荧光检测试剂盒又易出现假阳性问题，因此其检测结果的准确性是有待考究的。

由此可见，我国对于该病毒的检测技术还需要进一步的完善。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR 引物和探针及方法与应用，本发明在多株APPV基因序列比对基础上，基于5’端基因设计了特异性引物和探针，对猪非典型瘟病毒进行快速、准确地鉴别，具有简单、快速、灵敏度高和特异强的特点。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针，包括上游引物APPV F、下游引物APPV R以及探针APPV Probe，其中，上游引物APPV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，下游引物APPV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针APPV Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还公开了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR的方法，包括以下步骤：提取待检测样品的RNA，以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用上述的引物和探针对cDNA进行荧光定量RT-PCR 扩增；通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和 CT值，在扩增曲线正常的情况下，若CT值＞0时，则可记为阳性，若CT 值＝0时，则记为阴性。

可选地，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL、1号5×Prime Script Buffer 4μL、2号Prime ScriptRT Enzyme Mix 1μL、4号Random 6mers 2μL 和5号RNase Free dH₂O 9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。

可选地，所述反转录反应所需试剂为宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScript^TMRT试剂。