[发明专利]体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法在审

专利信息
申请号: 201810576866.5 申请日: 2018-06-06
公开(公告)号: CN108795863A 公开(公告)日: 2018-11-13
发明(设计)人: 胡庭俊;宋漫玲;韦英益;施君;谢小东;安慧青;朱瑜 申请(专利权)人: 广西大学
主分类号: C12N5/0786 分类号: C12N5/0786
代理公司: 广西南宁公平知识产权代理有限公司 45104 代理人: 杨立华
地址: 530004 广西壮族*** 国省代码: 广西;45
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摘要:
搜索关键词: 猪肺泡巨噬细胞 猪圆环病毒2型 感染 病毒感染 体外感染 体外模型 炎症模型 细胞炎性因子 动物疾病 活性氧水平 巨噬细胞系 动态变化 免疫细胞 模型构建 细胞活性 炎性因子 作用机制 肺泡 种体 治疗 应用 研究
【说明书】:

发明公开了一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法,即采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞系。该模型构建成本低、实用性强、技术先进。应用本发明建立猪肺泡巨噬细胞炎症体外模型后,通过测定病毒感染后细胞活性和炎性因子水平,可探讨PCV2病毒感染量、感染时间与细胞炎性因子水平及活性氧水平动态变化的相关性。因此,本发明为研究PCV2感染后能否引起免疫细胞炎症及作用机制提供了较理想的体外模型,进而将有可能为PCV2感染引起的动物疾病的治疗提供一些新思路。

技术领域

本发明属于细胞炎症模型技术领域,尤其涉及一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)是引起猪圆环病毒病(PCVD)和猪圆环病毒相关疾病(Porcine Circovirus-Associated Disease,PCVAD)的主要病原。近年来,随着养猪业的发展,猪圆环病等传染性疾病的流行,给全球养猪业造成了严重的经济损失。PCV2病毒主要侵害动物体的单核-巨噬细胞和抗原提呈细胞,PCV2感染后可引起的淋巴滤泡破坏和白细胞减少症可以导致猪的免疫抑制病等。猪肺泡巨噬细胞(porcinealveolar macrophage,PAM)是肺部免疫最早接触病原微生物的免疫防御细胞之一,在猪执行天然免疫和特异性免疫时起重要功能。在生理条件下,肺泡巨噬细胞的主要作用是清除组织内细胞碎片等,主要发挥抑炎作用,但对于组织损伤或是致病微生物等,肺泡巨噬细胞需要启动强大的促炎反应以维持组织稳态。当肺部受到损伤或是感染时,肺泡巨噬细胞的促炎作用强于抑炎作用,肺泡巨噬细胞可以产生并释放大量的炎症介质,如细胞因子、趋化因子、补体、危险信号分子等。这些炎症介质中有些为趋化因子,可以招募单核细胞和中性粒细胞,或作为刺激剂激活肺上皮细胞和间质巨噬细胞,从而建立肺部炎症环境。

PCV2感染后,猪肺泡巨噬细胞作为PCV2的靶细胞,是首先抵御肺部损伤的重要免疫细胞。PCV2感染猪肺泡巨噬细胞的程度也是病猪的肺部损伤程度的一个重要参考。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法,为研究PCV2感染后能否引起免疫细胞炎症及作用机制提供较理想的体外模型。

为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:

体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法,采用猪圆环病毒2型体外感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2细胞)。

上述体外感染猪圆环病毒2型建立猪肺泡巨噬细胞炎症模型的方法,包括以下步骤:

(1)3D4/2细胞经复苏传代后,待细胞达到一定数量后,细胞计数仪计数活细胞数>95%,调整细胞浓度备用;

(2)设置细胞对照组和不同浓度PCV2病毒感染组,加入DMEM培养液及相应浓度病毒液,与细胞吸附2h后弃液,加入1mL含5%FBS的DMEM培养液后继续培养,分别于第4、8、12、24、48h收样,用于细胞活性及与细胞分泌炎性相关因子指标的测定,确定病毒最适孵育浓度和炎症最适孵育时间。

步骤(1)按以下操作进行:3D4/2细胞复苏后,用含10%-FBS-DMEM培养液转入瓶中,于37℃、5%CO2培养箱中培养,待细胞长至70%-80%时进行传代,传代时用0.25%胰酶消化后以1∶2或者1∶3的比例进行传代培养,待细胞达到一定数量后,细胞计数仪计数活细胞数>95%,调整细胞浓度为1×106cell/mL备用。

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