[发明专利]用BsrGI鉴定人胃癌BCAR4基因rs4561483多态性的方法

说明书

本发明公开了用BsrGI鉴定人胃癌BCAR4基因rs4561483多态性的方法，包括以下步骤：抽提样品的基因组DNA；提供扩增人BCAR4基因多态性rs4561483位点附近序列的正向引物和反向引物，以所述待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获取扩增产物；使用限制性内切酶对所述扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定BCAR4基因多态性rs4561483位点的各基因型。本发明建立的BCAR4多态性rs4561483基因分型方法简单、快速、安全、准确、灵敏度高，值得在临床和研究中推广，并可借鉴用于其它多态性基因的分型。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用BsrGI鉴定人胃癌BCAR4基因rs4561483多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括碱基的置换/插入和缺失等形式。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，现已广泛用于简单和复杂疾病的遗传连锁分析/关联分析及疾病易感基因的定位，指导易感基因克隆。较常见的单碱基多态性位点的检测方法包括聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)，三引物等位基因扩增法(TP-PCR)和测序等方法。这些方法虽各有优点，但也各有其不足之处。

PCR-RFLP是一种快速、简便、准确的检测SNP基因型的经典方法。其原理是:限制性内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4-6bp)，并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的特异性意味着对特定等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的置换、插入和缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而改变酶切后产生片段的大小和数目。这些酶切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP产生和消除了某个限制性内切酶位点，则可以通过对PCR产物进行酶切、电泳加以检测。该方法的优点在于快速简单，终点判断准确。但其主要缺点在于酶切位点的选择，要求待测多态性位点和某一酶切位点相关。PCR-RFLP酶的选择具有局限性，并不是所有的SNP位点都可以用这种方法来鉴别，且部分内切酶价格昂贵，实验成本高。三引物等位基因扩增法(TP-PCR)是一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组DNA方法。反应体系中有2种模板和3种引物，从而在同一个反应体系中产生一个重组DNA分子。这种方法的主要优点是快速，不依赖连接片段的限制酶位点。但其缺点是扩增效率低，扩增特异性差，无法保证PCR产物的特异性和稳定性，分型结果易造成误判。Taqman荧光探针法是一种新型高效准确的基因分型方法，其优点是检测灵敏度高，分型准确。但该方法需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高。

BCAR4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4)是一种长链非编码RNA，其编码基因位于人类染色体16p13.13。BCAR4最初在乳腺癌细胞中抵抗雌激素耐药基因的筛选中被发现表达异常。后来的研究显示：CCL21释放SNIP的抑制剂——p300依赖的乙酰化组蛋白，使BCAR4结合到转录子SNIP1和PNUTS上，激活非经典Hedgehog/GLI2途径来促进细胞侵。BCAR4显示了在包括胃癌在内的各种数种肿瘤中的作用，它可以通过GLI2依赖的基因转录促进骨肉瘤的转移和侵袭，通过激活Wnt/β-联蛋白信号通路促进结直肠癌的发展，通过上皮间质转化作用促进非小细胞肺癌的侵袭。另外研究显示：BCAR4在胃癌组织中呈高表达，通过Wnt信号通路促进肿瘤发展，并且BCAR4与胃癌病人的肿瘤大小、临床分期和生存时间密切相关，预示着胃癌病人的不良预后。越来越多的研究发现lncRNA的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与胃癌易感性相关。BCAR4是和胃癌密切相关的lncRNA，而基因突变有可能影响lncRNA的调节作用，促使细胞发生癌变以及肿瘤发生、发展。