[发明专利]用BsrGI鉴定人胃癌BCAR4基因rs4561483多态性的方法

权利要求书

1.用BsrGI鉴定人胃癌BCAR4基因rs4561483多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)抽提样品的基因组DNA；

(b)提供扩增人BCAR4基因多态性rs4561483位点附近序列的正向引物和反向引物，以所述待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获取扩增产物；

(c)使用限制性内切酶对所述扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；

(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定BCAR4基因多态性rs4561483位点的各基因型。

2.根据权利要求1所述的用BsrGI鉴定人胃癌BCAR4基因rs4561483多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中所述正向引物和反向引物的设计与合成具体为：碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，确定BCAR4多态位点碱基变异数据；

含BCAR4 rs4561483的部分基因序列如SEQ:ID:NO:1所示；基因序列的第501个碱基R代表了G/A多态，即为rs4561483的多态性位点；根据rs4561483的具体序列和多态性碱基的位置采用Primer Premier 6.0设计出的最有上下游引物，正向引物序列如SEQ:ID:NO:2所示；反向引物序列：如SEQ:ID:NO:3所示，其中正向引物序列中倒数第2位碱基为G，错配后PCR产物中多态附近序列由TTTACG或TTTACA更改为TGTACG或TGTACA，其中第2个碱基G为错配碱基，第6个碱基G/A为多态位点；扩增产物中A等位基因片段能被识别T^GTACA序列的限制性内切酶BsrGI识别，A等位基因片段能被内切酶切开；进而根据片段切开情况来判断多态基因型；按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成采用固相合成法或者委托生物公司合成并检测正向和反向引物。

3.根据权利要求1所述的用BsrGI鉴定人胃癌BCAR4基因rs4561483多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中PCR扩增反应中制备PCR扩增体系具体为：2×Taq PCR Mix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μlPCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括35个循环三个步骤，首先94℃变性30s，62.1℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为163bp的PCR扩增产物；扩增后的产物的序列如SEQ:ID:NO:4所示。

4.根据权利要求1所述的用BsrGI鉴定人胃癌BCAR4基因rs4561483多态性的方法，其特征在于，步骤(c)中进行酶切的酶切体系具体为：PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切1-16h，即得酶切产物。

5.根据权利要求1所述的用BsrGI鉴定人胃癌BCAR4基因rs4561483多态性的方法，其特征在于，步骤(d)琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性具体为：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定；对于不同的基因型，rs4561483位点不同基因型展现出不同的条带，纯合野生基因型GG，长为208bp一条带；突变杂合基因型GA，长为208bp，185bp及23bp三条带；突变杂合基因型AA，185bp，23bp两条带。