[发明专利]用于诊断肝素诱导血小板减少症的活化试验

说明书

本发明涉及用于诊断肝素诱导血小板减少症的活化试验。具体而言，本发明涉及用于确定肝素诱导血小板减少症(HIT)的功能性、易自动化试验。其测量的是来自活化血小板的PF4(血小板因子4)的分泌。

技术领域

本发明属于体外诊断领域，并且涉及用于确定肝素诱导血小板减少症的功能性、易自动化的试验。

背景技术

肝素诱导血小板减少症(heparin-induced thrombocytopenia，HIT)是一种血栓性疾病，其可能发生在肝素治疗期间并且可能造成危及生命的血栓栓塞并发症。患者生成与肝素和血小板因子4(PF4)组成的复合物结合的抗体，该抗体被称为抗PF4/肝素复合物抗体。在体内，结合抗体的PF4/肝素复合物结合到血小板表面，并且造成血小板的活化。这导致血小板计数的减少以及血栓栓塞风险的增加。

HIT诊断中主要用到两条试验原理。第一试验原理是基于对患者体液样本中抗PF4/肝素复合物抗体的直接检测。为此，样本与PF4/肝素复合物或由PF4和另一合适聚阴离子(诸如聚乙烯磺酸根)组成的复合物接触，并且使用传统免疫测定法方法(例如，ELISA)检测存在于样本中的任意抗PF4/肝素复合物抗体的结合。然而，尽管抗PF4/肝素复合物抗体的检测是敏感的，但是缺点在于其不够特定，即抗体的检测不足以做出阳性的HIT诊断，而阴性结果会合适可靠地排除HIT。因此，建议采用基于第二试验原理的功能性试验进行确认。

第二功能性试验原理基于对抗PF4/肝素复合物抗体的血小板活化行为的检测。在所述试验原理中，从一个或多个正常供体上洗涤得到的血小板与来自患者的血浆或血精样本混合并且与肝素混合，并且基于已知活化标记，诸如基于所释放的血清素(血清素释放试验)的量或基于可目测识别的血小板聚集反应(HIPA试验)，测量血小板的活化。如果患者样本包含抗PF4/肝素复合物抗体，则可以确立相比正常样本(没有此类抗体)增加的血小板的活化。

迄今为止，不能在传统实验室中也不能以自动的方式执行两个所述功能性试验原理，因为其需要复杂的人工操作，因此只能由训练过的人员执行。此外，血清素释放试验需要通过离心步骤移除血小板并使用放射性物质。

发明内容

本发明的目的是：提供避免上述缺点的用于检测体液样本中抗PF4/肝素复合物抗体的功能性方法。

已经发现的是，通过对包含所查样本、血小板和肝素(或功能等同的PF4结合性多糖或聚阴离子)的反应混合物中PF4进行定量确定，可以确定样本是否包含抗PF4/肝素复合物抗体。所述反应混合物中，包含抗PF4/肝素复合物抗体的样本明显会造成血小板中PF4的分泌，这意味着反应混合物中PF4量的增加表明抗PF4/肝素复合物抗体的存在，并且因此表明肝素诱导血小板减少症的存在。

因此，本发明提供了一种检测体液样本中抗PF4/肝素复合物抗体的方法。该方法包括以下步骤：

i.通过将样本、包含血小板的试剂以及PF4结合性非支链多糖混合或与PF4结合性聚阴离子混合，提供反应混合物；

ii.温育反应混合物；并且之后

iii.确定反应混合物中PF4的量；

iv.将所确定的反应混合物中PF4的量与包含已知不含抗PF4/肝素复合物抗体的供体体液样本的反应混合物中PF4的量的预定的参考值进行比较；并且

v.当确定在反应混合物中的PF4的量超过参考值时，确立抗PF4/肝素复合物抗体的存在于样本中。

体液样本优选地来自人。优选地，体液样本基本上不含血小板，并尤其是血浆或血清。