[发明专利]一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法

说明书

本发明公开了一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法，属于细胞培养领域。本发明通过在星形胶质细胞培养基中添加表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，SAG和Purmorphamine，可以明显的延长星形胶质细胞体外培养时间、增加传代次数、提高纯度、并能保持星形胶质细胞原有特性。发明人研究发现，本发明的培养基可以隔代使用，并维持星形胶质细胞传代至13代。培养至12代的星形胶质细胞纯度95％，并能保持星形胶质细胞原有特性。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法。

背景技术

星形胶质细胞(Astrocytes)是遍布整个中枢神经系统，从事多种复杂功能的一类胶质细胞，与神经元发生物质交换，对神经元的生长起着不可或缺的作用。鉴别星形胶质细胞主要的依据在于其能表达一种胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。在中枢神经系统中，应激性星形胶质细胞(Reactive astrocytes)会对各类损伤做出反应，最终形成胶质疤痕。生物学上常以此来判断中枢神经系统的损伤部位。星形胶质细胞参与血脑脊液屏障，对中枢神经系统血流有一定调节作用，进而对神经元的活动造成影响；星形胶质细胞与突触连接，对神经元的稳态起重要作用(Sofroniew and Vinters,2010)。最新的研究发现，在体外，星形胶质细胞可在特定的小分子化合物作用下转化成神经元，为癫痫、阿尔兹海默综合症、帕金森综合症等疾病的治疗开启了新的篇章(Zhang et al.,2015)，体外培养星形胶质细胞也成为研究胶质细胞的转换必不可缺少的一步，优化星形胶质细胞体外纯化传代的方法，为诱导其“活化”，为深入研究中枢神经系统提供了良好的模型。

现有的星形胶质细胞纯化传代的方法仍然存在一定的局限，研究的成果主要集中在星形胶质细胞纯化方面，在其体外培养传代，并保持细胞较好活性方面依旧没有新的进展。现有的技术普遍是在DMEM/F12培养基中培养，传代至第四代细胞就无法正常生长，贴壁后十分稀疏，不构成连接，最终个体细胞死亡。原代培养的细胞可含有5～10％的成纤维细胞和少突胶质细胞，并且此类细胞生长分裂旺盛，后期较难去除。Skytt.等人为去除此类细胞的污染，至细胞原代培养起在3周时间内将培养液中FBS浓度从20％至10％梯度降低，得到了≥95％的纯度(Skytt et al.,2010)。刘晓梅等通过对原代培养的细胞以不锈钢网(Φ＝200μM)过滤，一般每次传代后需要7～8天细胞才能铺满25cm²的培养瓶，传代时间长，通过多次更换培养基，然而细胞只能传至第三代，且实验的成本较高。刘晓梅的方法中，在培养过程中，多次对细胞进行换液，星形胶质细胞的生长环境多次变化，不利于细胞的分裂分化，甚至导致部分细胞死亡。很多研究表明，在培养的最后一周添加0.25μM二丁酰环腺苷酸(dBcAMP)可以增强星形胶质细胞的分裂活性(Lange et al.,2012)。但是此方法对多次传代的细胞作用较小，传代过程中失去分裂活性的细胞并不能通过添加dBcAMP再次获得分裂属性。同时，该培养方法耗用的成本较高，操作流程复杂。

综上，目前培养星形胶质细胞的方法较复杂，细胞生长较慢，一般体外培养至第三代才得到75～95％的星形胶质细胞纯度。实验过程中的多次更换培养基等操作不仅增加了实验的成本，还不利于细胞在相对稳定的环境中生长，增加了染菌的可能性。为使传代细胞保持分裂、分化活性而添加的dBcAMP对延长细胞传代、增加传代细胞可用的代数无明显作用。

目前，星形胶质细胞作为神经科学研究领域的研究重点，我们迫切需要一种能延长星形胶质细胞体外培养时间、增加传代次数、提高纯度、保持星形胶质细胞原有特性的培养基及培养方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法以及体外培养的星形胶质细胞。所述培养基体外培养星形胶质细胞可以延长星形胶质细胞体外培养时间、增加传代次数、提高纯度、保持星形胶质细胞原有特性。

本发明所采取的技术方案是：