[发明专利]一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法

说明书

本发明公开了一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，芳香化合物的催化合成是以木质素来源的分别以阿魏酸等木质素来源的酚酸为底物，所述全细胞为转入芳香酚单加氧酶基因amp和酚酸脱羧酶基因pad的重组大肠杆菌，在高温和碱性条件下，重组大肠杆菌可以将这些酚酸转化为相应的高价值芳香化合物。这种方法用全新的全细胞催化剂来合成高价值芳香化合物，避免了辅因子的添加，大大提高了效率和节约了成本。本发明为木质素资源的利用开辟了新的技术，具有重要的应用前景。

技术领域

本发明涉及芳香化合物的合成领域，尤其涉及一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法。

背景技术

近年来，基于木质纤维素资源和农业废弃物的生物炼制为石化资源短缺和日益凸显的环境问题提供了一条综合的解决方案。然而，传统的生物炼制以及造纸行业每年会产生超过3亿吨的木质素废弃物，其中，超过98％的木质素废弃物被用作燃烧产热，这一过程造成了资源的大量浪费以及严重的环境污染。随着利用木质纤维素来生产生物乙醇的生物炼制过程的快速发展，到2030年后每年将多产生超过2.2亿吨的木质素废弃物，这成为了当下生物炼制发展的最大挑战。另一方面，占据木质纤维素15％-30％量的木质素是最大的天然芳香化合物资源，最近，对于这类可再生资源的利用受到越来越多的关注。阿魏酸和对香豆酸是木质素中含量最大芳香单体，可以简单的通过热化学解聚或者酶解木质素得到。因此，为了发展更加可持续和具有竞争力的生物炼制，开发将这些易获取的木质素来源的酚酸转化为高价值芳香化合物的绿色技术显得极为关键。阿魏酸是生物法合成香兰素的主要原料，而对香豆酸可以用于四乙烯基苯酚的制备。香兰素具有“香料皇后”的美誉，被广泛的应用于食品、香精香料、饮料及医药领域，其年需求量高达16,000吨。同时，香兰素也越来越多的用于热固树脂和热固塑料的合成。四乙烯基苯酚可以用于聚合材料的生产，应用于光电导管和半导体制造领域。然而，包括香兰素在内这些高价值芳香化合物在植物中的含量非常低，同时，分离和提取过程复杂，使得它们的产量不能满足日益增长的需求量。化学合成法依赖于石油化工产品和能源，并会对生态环境造成一定危害。基于这些原因，利用阿魏酸等木质素来源的羧酸通过生物法生产香兰素等高价值芳香化合物是一条理想的途径。

温和的反应条件、快速高效的生产过程和清洁无污染等优势使得微生物发酵生产高价值芳香化合物成为了最具潜力的合成方法。以香兰素为例，包括链霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌和大肠杆菌在内的多种微生物可以转化阿魏酸生成香兰素。尽管如此，负责这类芳香羧酸转化的阿魏酰辅酶A合酶依赖于ATP和辅酶A，因此，对于ATP和辅酶A的需求严重限制了阿魏酸等木质素来源的酚酸的利用效率。Lee等人尝试通过在大肠杆菌中构建辅酶A循环系统来提高阿魏酸的转化效率，然而能源的需求仍然限制了该途径。最近，Furuya等人发现了一个辅酶A不依赖的脱羧酶可以将四乙烯基愈创木酚转化为香兰素，但是该酶对碱性环境的依赖使得其不能与将阿魏酸转化为四乙烯基愈创木酚的酚酸脱羧酶配合使用，需要进行两步法反应才能得到香兰素。这其中，对于酸碱性条件的更换和两种休止细胞的制备等繁琐过程影响了该方法的应用。同时，这个辅酶A不依赖的脱羧酶的活性很低，使得香兰素的生产效率低下，不能满足商业化的需求。因此，需要构建新的生物转化体系，可以在不依赖辅因子的条件下将阿魏酸和对香豆酸等木质素来源的酚酸一步高效转化为高价值芳香化合物。然而，目前并未有不依赖辅因子的这种生物催化剂的报道。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是现有生物催化体系对辅因子的依赖，该依赖严重降低了生物转化的效率，同时解决不依赖辅因子需要切换酸碱环境和制备多种休止的细胞的技术问题。