[发明专利]一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法

权利要求书

1.一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述芳香化合物的催化合成是以木质素来源的阿魏酸为底物，所述芳香化合物为香兰素；所述全细胞为转入芳香酚单加氧酶基因amp和酚酸脱羧酶基因pad的重组大肠杆菌，所述香酚单加氧酶基因amp来源于Thermothelomyces thermophila，蛋白序列为SEQ ID NO.1，所述酚酸脱羧酶基因pad来源于凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，蛋白序列为SEQ ID NO.2，具体包括如下步骤：

第一步：重组质粒的构建，将芳香酚单加氧酶基因amp和酚酸脱羧酶基因pad连接入大肠杆菌表达质粒中，

第二步：基因工程菌的构建，将重组质粒转入大肠杆菌中，筛选并验证阳性大肠杆菌重组菌株；

第三步：全细胞催化液反应液制备，活化并诱导细胞表达芳香酚单加氧酶和酚酸脱羧酶，离心后用的NaHCO₃/Na₂CO₃碱性缓冲液重悬菌体，获得全细胞催化反应液；

第四步：以木质素来源的所述阿魏酸为底物，以全细胞催化剂生产所述芳香化合物香兰素。

2.如权利要求1所述的不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述芳香酚单加氧酶基因amp和酚酸脱羧酶基因pad根据大肠杆菌密码子的偏好性进行优化，所述优化后的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

3.如权利要求1所述的不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述第三步中NaHCO₃/Na₂CO₃碱性缓冲液的pH为9.5。

4.如权利要求1所述的不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述第四步具体包括：向全细胞催化反应液中加入终浓度为100mM的所述阿魏酸，45-50℃搅拌16-20h，用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，离心后得到的上层液体含有的产物为所述香兰素。

5.如权利要求4所述的不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述离心的转速为5000rpm，离心时间为15min，搅拌温度为50℃。

6.一种按照权利要求1-5任意一项所述的不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法在合成芳香化合物香兰素中的应用。