[发明专利]小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法

说明书

本发明公开了一种小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，包括如下步骤：①获取人源可诱导多能性干细胞；②使用不含有碱性成纤维细胞生长因子的E7培养基对人源可诱导多能性干细胞进行预处理培养；③使用分化培养基并结合小分子诱导剂诱导人源可诱导多能性干细胞进行分化，小分子诱导剂包括有DHH激动剂SAG、22R‑OHC、氯化锂、人血小板衍生生长因子AA、成纤维生长因子2、胰岛素样生长因子1、雄激素、促黄体生成素、视黄醇和八溴环磷酸腺苷；④手工剔除克隆团样杂细胞；⑤剔除杂细胞后剩下的细胞用富集培养基继续培养，富集培养基定期更换，最终获得目标睾丸间质细胞。

技术领域

本发明涉及一种诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，尤其涉及一种由小分子诱导人源可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法。

背景技术

男性生殖健康离不开生殖系统的功能健全。目前，雄激素缺乏症的治疗方法仅停留在雄激素替代治疗。然而，长期的雄激素治疗会引起肝肾功能损伤、免疫力降低、水钠潴留等并发症，而且不受自身昼夜节律的调控。虽然睾丸间质细胞移植可以避免外源性雄激素替代治疗带来的某些并发症，但是睾丸间质细胞来源不足和异体移植可能导致宿主免疫排斥反应限制了睾丸间质细胞在临床上的应用。

目前，诱导全能干细胞或成体干细胞分化为睾丸间质细胞作为供体移植是国际上公认的解决上述问题的突破口。全能干细胞，如胚胎干细胞虽然是一种很好的种子细胞，它理论上能被诱导分化为各种类型的细胞，包括睾丸间质细胞。但是，在临床应用中，胚胎干细胞面临着由于涉及人体胚胎存在伦理学问题，同时也无法克服免疫排斥反应的问题。

可诱导多能性干细胞是一种类似于胚胎干细胞的多能性干细胞。可诱导多能性干细胞既具备了胚胎干细胞一样的多能性，同时它可以从任何一种来自患者自体细胞重编程获取，彻底规避了胚胎干细胞应用中所面临的免疫排斥和伦理学问题，具备了巨大的临床应用价值。

现有技术中，还未有出现通过小分子将此可诱导多能性干细胞诱导分化为睾丸间质细胞的方法。因此，本发明人对此提出了本申请的技术方案。

发明内容

本发明的目的是诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，尤其是一种由小分子作为诱导剂对可诱导多能性干细胞进行诱导，使之分化为睾丸间质细胞的方法。

所述可诱导多能干细胞是指人源可诱导多能性干细胞，具体方法包括如下步骤：

①获取人源可诱导多能性干细胞；

②使用不含有碱性成纤维细胞生长因子的E7培养基对人源可诱导多能性干细胞进行预处理培养；

③使用分化培养基培养并结合小分子诱导剂诱导人源可诱导多能性干细胞进行分化，小分子诱导剂包括有DHH激动剂SAG、22R-OHC、氯化锂、人血小板衍生生长因子AA、成纤维生长因子2、胰岛素样生长因子1、雄激素、促黄体生成素、视黄醇和八溴环磷酸腺苷

④手工剔除克隆团杂细胞；

⑤剔除所述杂细胞后剩下的细胞用富集培养基继续培养，所述富集培养基定期更换，最终获得目标睾丸间质细胞。

为进一步完善上述方案，本发明进一步设置为：步骤①中所述人源可诱导多能性干细胞由人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞经细胞培养获得，具体方法包括如下步骤：将人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞接种在质量体积比1%基质胶处理过（至少37℃孵育1小时以上）的6孔板上，并置于37℃二氧化碳培养箱内培养，每天全量更换新鲜的E8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代稀释比例为6:1，在每次传代后的第1天，培养基中需要添加10 μM Y-27632。