[发明专利]小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法

权利要求书

1.一种小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述可诱导多能干细胞是指人源可诱导多能性干细胞，具体方法包括如下步骤：①获取所述人源可诱导多能性干细胞；②使用不含有碱性成纤维细胞生长因子的E7培养基对所述人源可诱导多能性干细胞进行预处理培养；③使用分化培养基并结合小分子诱导剂诱导所述人源可诱导多能性干细胞进行分化，所述小分子诱导剂包括有DHH激动剂、22R-OHC、氯化锂、人血小板衍生生长因子AA、成纤维生长因子2、胰岛素样生长因子1、雄激素、促黄体生成素、视黄醇和八溴环磷酸腺苷；④手工剔除克隆团样杂细胞；⑤剔除所述杂细胞后将剩下的细胞用富集培养基继续培养，所述富集培养基定期更换,最终获得目标睾丸间质细胞；

步骤②至⑤具体如下：

所述的克隆团样iPSC达到70%融合时，定义此时间点为第-2天，此时细胞培养基换成不含bFGF的E7培养基进行培养，预处理2天，定义此时时间点为第0天，然后将培养基换成分化培养基iPSC-DIM：DMEM/F12、体积百分比1% 牛血清白蛋白BSA、5 mM ITS和5 ng/mL LH，从第0至7天，在分化培养基中加入0.2μM SAG、5μM 22R-OHC和5 mM LiCl进行早期分化诱导，从第7至10天，在分化培养基中加入5 ng/mL PDGF-AA和5 ng/mL FGF2进行早期促增殖诱导；

从第10至17天，在分化培养基中加入5 ng/mL PDGF-AA、5 nM IGF-1和10 μM Androgen进行中期分化诱导，从第17至20天，在分化培养基中加入10 ng/mL PDGF-AA和10 ng/mLFGF2进行中期促增殖诱导，从第20至25天，在分化培养基中加入5 ng/mL LH、0.5 mM RA和1mM 8Br-cAMP进行晚期成熟分化诱导，期间培养基每两天更换一次，然后通过手工富集的方式，剔除克隆团iPSC样的杂细胞；

剩下的细胞用富集培养基继续培养5天，富集培养基主要含有：DMEM/HG、体积百分比5%FBS、体积百分比2.5% HS、1×Sodium pyruvate、1×GlutaMAX和体积百分比1% P/S，期间培养基每两天更换一次。

2.根据权利要求1所述的小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：步骤①中所述人源可诱导多能性干细胞由人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞经细胞培养获得，具体方法包括如下步骤：将人源尿液细胞重编程来源的可诱导多能性干细胞接种在质量体积比1%的基质胶处理过且至少37℃孵育1小时以上的6孔板上，并置于37℃二氧化碳培养箱内培养，每天全量更换新鲜的E8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代稀释比例为6:1，在每次传代后的第1天，培养基中需要添加10 μM Y-27632。

3.根据权利要求1或2所述的小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：在获取所述人源可诱导多能性干细胞过程中，为减少对人源可诱导多能性干细胞的损伤，传代时使用质量体积比0.25% EDTA处理3-5分钟，当克隆团边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部时，用不含Mg²⁺离子的PBS洗1遍，然后用1 mL的 E8培养基轻轻吹打且吹打次数不超过10次，收集细胞接种到新的被质量体积比1%基质胶预处理过且至少37℃孵育1小时以上的6孔板上继续培养。

4.根据权利要求1所述的小分子诱导可诱导多能性干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于：对富集培养基中所培养的目标睾丸间质细胞进行鉴定，鉴定的方法包括免疫荧光鉴定、逆转录PCR检测和蛋白印记检测。