[发明专利]一种动物细胞低温冷藏保存和运输的方法

说明书

本发明公开了一种可用于动物细胞的低温冷藏保存和运输方法。该方法包括(1)细胞培养容器中加入处理好的多孔微载体和含血清培养基，将细胞悬液按所需接种密度接种到容器中培养。(2)细胞生长达到对数生长期后，用细胞活性保存液将培养基置换出来。(3)将附着在多孔微载体的细胞悬浮在细胞活性保存液中，转移到保存容器中，装液量要达到90％左右。(4)放入4‑8℃冷藏保存或运输。通过定期更换保存液，可以在半个月内冷藏保存保存细胞而活性不损失。解决已经复苏的细胞储存和运输问题，避免了反复冻融对细胞的损害。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种动物细胞低温保存运输的方法。特别的，本发明涉及一种利用多孔微载体低温冷藏保存和运输细胞的方法。

背景技术

各种原代培养或传代培养的细胞或细胞株是细胞生物学和生物医药领域重要的研究对象。为了最大限度的保证细胞的遗传稳定性，目前最通用的做法是将所培养的细胞在生长旺盛期时进行冻存，冻存细胞储存在加入细胞冻存液的细胞冻存管中，然后放置于-196℃的液氮中，在这种超低温环境下，细胞可以长期保存。在实验需要时，可以将所冻存细胞在37℃复苏使用。

然而，在常温或37℃环境中，细胞内各种酶和其他生物大分子大分子反应、代谢旺盛，耗氧高，能耗大。这些生理过程会产生的大量氧自由基和脂质过氧化物。会引起细胞培养液中pH和渗透压变化，造成细胞溶胀和死亡。因此，复苏后的细胞无法在常温环境中保存和运输，过多的传代也无法保持其遗传稳定性。

因此，细胞株在使用和运输过程中不可避免的会反复经历冷冻和复苏过程。绝大多数细胞在-5℃～-60℃时，胞内形成冰晶，导致细胞死亡，因此-5℃～-60℃称作细胞的危险温度区。当细胞从-196℃低温环境中拿到-20℃以上的环境中，再由这样的环境温度回到-196℃的液氮中。这样剧烈的温度变化会使冷冻细胞活性和质量带来严重的影响。因此，反复的冻融过程会造成细胞损伤。

荷兰学者van Wezel于1967年首先创立了微载体培养动物细胞技术，其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时可以在较短时间内得到大量的细胞。20世纪80年代，微载体出现了商品化。多孔载体(porous carriers)是近年来才发展起来的一种用于大规模高密度动物细胞培养的优秀的细胞支持物。多孔载体内部有许多网状的相互连通的孔结构，细胞可以进入孔中生长、分裂，而微载体就象细胞外基质(extracellular matrix)一样提供细胞生长的三维骨架，可以避免流体剪切力对细胞造成的强烈冲击，增加细胞稳定性，此项技术被广泛应用于生物医学领域。

发明内容

本发明提供了一种用于低温冷藏条件下细胞短时储存和转移运输的方法，目的是为了克服现有技术中细胞的保存与转移时需要反复冻融而导致活性损失的缺陷，提出了一种可用于复苏细胞冷藏保存和运输的方法。

本发明主要是通过以下技术方案来实现:

本发明公开了一种可用于动物细胞的低温冷藏保存和运输方法。该方法包括(1)细胞培养容器中加入处理好的多孔微载体和含血清培养基，将细胞悬液按所需接种密度接种到容器中培养。(2)细胞生长达到对数生长期后，用细胞活性保存液将培养基置换出来。(3)将附着在多孔微载体的细胞悬浮在细胞活性保存液中，转移到保存容器中，装液量要达到80-90％左右。(4)放入4-8℃冷藏保存或运输。通过定期更换保存液，可以在半个月内冷藏保存保存细胞而活性不损失。

本发明所述的细胞是指动物细胞，包括原代细胞和细胞株，尤其是指新鲜获取的原代细胞或者复苏后处于培养状态的细胞株；

本发明所述的保存是指短时间内对于细胞不进行任何操作的状态，尤其是指在研究过程中，每一次试验间隙，对处于生长状态下的细胞的短时间的保存，目的是维持细胞的生长状态，避免反复冻融对于细胞的损伤，保持试验材料的均一性，提高试验效率。