[发明专利]貉细小病毒病毒样颗粒、其制备方法与应用以及该病毒样颗粒制备的疫苗

说明书

貉细小病毒病毒样颗粒、其制备方法与应用以及该病毒样颗粒制备的疫苗，属于重组疫苗制备领域。本发明针对貉细小病毒肠炎灭活疫苗免疫效力较低，活疫苗毒力返强的问题，提供了一种貉细小病毒病毒样颗粒，是将经过密码子优化的貉细小病毒基因RDPV‑VP2‑OPTI与昆虫表达载体pFastBac1连接得到供体质粒，然后转化到杆状病毒DH10 Bac E.coli中经培养获得表达貉细小病毒RDPV‑VP2蛋白的重组杆状病毒，然后转染SF21细胞，培养至细胞出现感染后收集细胞病毒液获得的。所述貉细小病毒病毒样颗粒与氢氧化铝胶佐剂混合后可制备获得貉细小病毒性肠炎疫苗。本发明适用于貉细小病毒性肠炎疫苗的制备。

技术领域

本发明属于重组疫苗制备领域，具体涉及一种貉细小病毒病毒样颗粒、其制备方法与应用以及该病毒样颗粒制备的疫苗。

背景技术

貉细小病毒性肠炎主要引起貉的肠炎，死亡率可达30％-60％，目前预防该病的主要手段是疫苗免疫，制备该疫苗目前现有的主要为全病毒灭活苗或活疫苗，主要缺点是灭活疫苗存在免疫效力较低，活疫苗存在毒力返强的风险。

发明内容

本发明针对目前貉肠炎灭活疫苗免疫效力较低，活疫苗毒力返强的问题，提供了一种貉细小病毒病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒转染SF21细胞，培养至细胞出现感染后获得。

进一步地，所述表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒是将经过密码子优化的貉细小病毒基因RDPV-VP2-OPTI与昆虫表达载体连接得到供体质粒，然后将该供体质粒转化到杆状病毒中经培养获得的，所述经过密码子优化的貉细小病毒基因RDPV-VP2-OPTI，序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述昆虫表达载体为pFastBac1，所述杆状病毒为DH10 Bac E.coli。

本发明还提供了一种貉细小病毒性肠炎疫苗，所述疫苗含有上述的貉细小病毒病毒样颗粒。

本发明还提供了上述貉细小病毒病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)病毒基因组的提取：将分离的貉细小病毒RDPV-HeB17株接种于F81细胞中，培养至75％以上病变后，收集病毒液提取病毒基因组DNA，所述貉细小病毒株RDPV-HeB17保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.15483。

(2)貉细小病毒RDPV-VP2-OPTI供体质粒构建：以步骤(1)提取的貉细小病毒DNA为模板，PCR扩增获得RDPV-VP2基因序列，其序列如SEQ ID NO:2所示，根据昆虫细胞偏爱密码子，对RDPV-VP2基因序列进行密码子优化，所述优化后的基因RDPV-VP2-OPTI，序列如SEQID NO:1所示，以RDPV-VP2-OPTI模板，PCR扩增获得SF-RDPV-VP2-OPT1，经酶切后连入经同样酶切的昆虫表达载体pFastBac1中，得到供体质粒pFastBacI-RDPV-VP2-OPTI。

(3)貉细小病毒RDPV-VP2-OPTI重组杆状病毒的构建：将供体质粒转化杆状病毒DH10Bac E.coli感受态细胞，获得表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒。

(4)转染及收获病毒：将步骤(3)获得的重组杆状病毒转染SF21细胞，培养至细胞出现感染后收集细胞病毒液，获得貉细小病毒病毒样颗粒。

优选地，步骤(2)所述用于扩增RDPV-VP2基因的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；所述用于扩增RDPV-VP2-OPTI基因的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，步骤(2)所述SF-RDPV-VP2-OPT1及昆虫表达载体pFastBac1双酶切所用的内切酶为NotⅠ和HindⅢ。