[发明专利]貉细小病毒病毒样颗粒、其制备方法与应用以及该病毒样颗粒制备的疫苗

权利要求书

1.一种貉细小病毒病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒转染SF21细胞，培养至细胞出现感染后获得；

所述表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒是将经过密码子优化的貉细小病毒基因RDPV-VP2-OPTI与昆虫表达载体连接得到供体质粒，然后将该供体质粒转化到杆状病毒中经培养获得的，所述经过密码子优化的貉细小病毒基因RDPV-VP2-OPTI，序列如SEQID NO:1所示。

2.根据权利要求1 所述的貉细小病毒病毒样颗粒，其特征在于，所述昆虫表达载体为pFastBac1，所述杆状病毒为DH10 Bac E.coli。

3.一种貉细小病毒性肠炎疫苗，其特征在于，含有权利要求1或2所述的貉细小病毒病毒样颗粒。

4.权利要求1或2所述的貉细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）病毒基因组的提取：将分离的貉细小病毒RDPV-HeB17株接种于F81细胞中，培养至75%以上病变后，收集病毒液提取病毒基因组DNA，所述貉细小病毒株RDPV-HeB17保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 15483；

（2）貉细小病毒RDPV-VP2-OPTI供体质粒构建：以步骤（1）提取的貉细小病毒DNA为模板，PCR扩增获得RDPV-VP2基因序列，其序列如SEQ ID NO:2所示，根据昆虫细胞偏爱密码子，对RDPV-VP2基因序列进行密码子优化，所述优化后的基因RDPV-VP2-OPTI，序列如SEQID NO:1所示，以RDPV-VP2-OPTI模板， PCR扩增获得 SF-RDPV-VP2-OPT1，经酶切后连入经同样酶切的昆虫表达载体pFastBac1中，得到供体质粒pFastBacI-RDPV-VP2-OPT1；

（3）貉细小病毒RDPV-VP2-OPTI重组杆状病毒的构建：将供体质粒转化杆状病毒DH10Bac E.coli感受态细胞，获得表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒；

（4）转染及收获病毒：将步骤（3）获得的重组杆状病毒转染SF21细胞，培养至细胞出现感染后收集细胞病毒液，获得貉细小病毒病毒样颗粒。

5.根据权利要求4所述的貉细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）中用于扩增RDPV-VP2基因的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；用于扩增RDPV-VP2-OPTI基因的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求4所述的貉细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述SF-RDPV-VP2-OPT1及昆虫表达载体pFastBac1双酶切所用的内切酶为NotⅠ和HindⅢ。

7.根据权利要求4所述的貉细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）、步骤（4）所述细胞出现病变或感染后，细胞病毒液收集的方法为：将病变或感染细胞反复冻融2次，将细胞上清液于1000 rpm离心5 min，然后用0.2 um的滤膜过滤，获得细胞病毒液。

8.权利要求1或2所述的貉细小病毒病毒样颗粒在制备貉细小病毒性肠炎疫苗中的应用，其特征在于，将貉细小病毒病毒样颗粒与氢氧化铝胶佐剂混合后制备获得貉细小病毒性肠炎疫苗，所述氢氧化铝在该疫苗中的终浓度为5%。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述用于制备貉细小病毒性肠炎疫苗的貉细小病毒病毒样颗粒对猪红细胞的血凝效价为2⁸~2¹²。