[发明专利]蛋白质翻译过程中直接实现脂肪酸修饰的表达系统及应用

说明书

本发明公开了一种在翻译过程中直接实现蛋白质脂肪酸修饰的表达系统，包括脂肪酸类非天然氨基酸ε‑N‑庚酰基赖氨酸(ε‑N‑heptanoyl‑Lysine，HepoK)盐酸盐或三氟乙酸盐，以及对HepoK特异的正交氨酰tRNA合成酶突变体和表达宿主。本发明利用遗传编码非天然氨基酸技术(Genetically Encoding Unnatural Amino Acid，GEUAA)将HepoK定点插入目标蛋白中琥珀终止密码子(TAG)编码的位置，在表达宿主体内高效、特异、定量、均一地实现了蛋白质脂肪酸修饰，彻底克服了体外化学修饰效率偏低、修饰均一度差、产物分离困难等多种局限。本发明还首次实现了药物蛋白胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)的共翻译脂肪酸修饰，并证明修饰不影响其生物活性。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，特别涉及一种药物蛋白的制备。

背景技术

随着生物技术的高速发展，蛋白质多肽类药物已成为21世纪医药研发领域中最活跃、进展最快的药物之一。目前被批准上市的蛋白药物超过200种，除了抗体和Fc融合蛋白以外，还有很大一部分低分子量蛋白药物，例如激素、生长因子、细胞因子、凝血因子等，由于相对较小的分子尺寸，它们容易被肾过滤(阈值为～50kDa)从血循环中迅速清除，加上蛋白酶降解和受体介导的胞吞作用，使其血液半衰期普遍偏短(几分钟至几小时)。为了维持药物作用的有效浓度，给药频率和剂量必须加大，潜在副作用风险增加，同时也导致患者的依从性大幅度降低。为了克服上述问题，研究人员逐渐发展出了多种蛋白长效化技术，通过提高蛋白分子的稳定性(例如定点突变)、增加流体动力学体积(例如聚合缓释、糖修饰、PEG修饰)或者利用新生儿Fc受体(FcRn)介导的再循环(例如白蛋白融合、Fc融合)等来延长蛋白药物体内的半衰期。然而现有技术均存在各种限制而缺乏通用性。蛋白药物的长效化机制和技术研究仍然是生物制药的重要方向。

长期以来，与人血清白蛋白(HSA)融合或结合被认为是延长药物蛋白半衰期的优选策略。因为HSA在人体内具有非免疫原性，生物相容性和可降解性；并且HSA分子尺寸超过肾过滤阈值，还可利用FcRn介导的细胞内降解逃逸机制，使得HSA在人体内血清半衰期长达19天。人们期望通过药物蛋白与HSA的融合表达来实现药物蛋白的长效化。然而，大部分结果难以达到预期，因为晶体结构显示，FcRn与HSA结合时，会同时与其N端的D1亚基以及C端的D3亚基相互作用。如果将蛋白直接融合到HSA上，可能会遮蔽这两个亚基中的一个，降低药物蛋白-HSA偶联物与FcRn的亲和力，从而不能有效延长其半衰期，而且与HSA的融合还可能阻碍药物蛋白与靶点的结合，从而降低药效。因此脂肪酸介导的、与HSA可逆地结合是个更有效的长效化方案:首先，HSA具有多达7个以上的脂肪酸特异结合位点(见图1)；其次，脂肪酸修饰有更多的位置选择，除了药物蛋白的N端，C端，理论上其他氨基酸残基的官能团也可进行脂肪酸修饰；再次，脂肪酸分子尺寸小，对药物蛋白自身空间结构影响小，药物可以保持更加良好的生物活性，而且脂肪酸与HSA结合后，几乎不影响其与FcRn的结合；最后，脂肪酸是构成人体脂肪、类脂和细胞膜磷脂的重要成分，脂肪酸修饰还有助于提高药物的脂溶性，增大肠道黏膜透过性及吸收效率，增强药物与受体的结合，甚至有潜能实现蛋白药物口服给药。因此蛋白质的脂肪酸修饰是新一代的蛋白药物长效化方案。

天然蛋白的脂肪酸修饰(脂化)主要形式有N-肉豆蔻酰化、S-法尼基化、S-棕榈酰化、S-香叶基香叶基化，胆固醇修饰以及磷脂酰乙醇胺修饰等，均在体内通过各种酶来催化实现，具有底物特异性和特定的修饰位点。为了降低免疫原性，蛋白药物脂肪酸修饰原则上模拟天然脂质蛋白结构，但蛋白药物自身通常并非脂化酶的底物，也无脂化位点，因而无法通过普通的重组蛋白生产体系或者体外酶催化来获取。迄今为止，蛋白药物的脂肪酸修饰主要通过化学全合成(多肽)或者体外化学偶联来实现(蛋白)。已经上市的脂肪酸修饰药物如地特胰岛素、德谷胰岛素、利拉鲁肽及索马鲁肽，均通过体外化学反应来生产：地特胰岛素采用肉豆蔻酸琥珀酰亚胺脂酰化第29位赖氨酸残基来完成修饰，其他三种则是以谷氨酸作为接头连接脂肪酸链和药物分子。