[发明专利]一种杂交鹅掌楸亲缘关系的鉴定方法

权利要求书

1.一种杂交鹅掌楸亲缘关系鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取后代树种的叶片DNA；

2)进行PCR检测；

3)用引物18.2能特异性扩增出400bp的产物的母本为中国鹅掌楸，能特异性扩增出382bp的产物母本为北美鹅掌楸；

4)再用引物700对已鉴别为母本为中国鹅掌楸的进行PCR扩增，能特异性扩增出700bp产物的母本为中国鹅掌楸西部种源，能特异扩增出242bp产物的母本则为中国鹅掌楸东部种源；对已鉴别为母本为北美鹅掌楸的用引物700进行PCR扩增，均特异获得700bp的产物。

2.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸亲缘关系的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，叶片为刚展开的嫩叶，液氮处理后放置-80℃备用。

3.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸亲缘关系鉴定方法，其特征在于，步骤2)中，DNA提取采用CTAB法进行。

4.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸亲缘关系鉴定方法，其特征在于，步骤3)中，PCR扩增的10μL体系为：75ng基因组DNA，1.0μL 10×PCR Buffer，1.2μL 2.5mM·L^-1MgCl，0.2μL10mM·L^-1dNTP，0.5μL 10μM·L^-1引物18.2左端引物，0.5μL 10μM·L^-1引物18.2右端引物和0.5个单位Taq酶，ddH₂O补足10μL，其中，引物18.2左端引物序列为：AATTCTCTCAATTTCACTTTGCCT；引物18.2右端引物序列为：TGGTCGATGCATTCTGTTTCT。

5.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸亲缘关系鉴定方法，其特征在于，步骤3)中，采用Touch-downPCR扩增程序：95℃预变性4min，94℃变性15s，60℃(△＝-1℃)复性30s，72℃延伸30s，6个循环；94℃变性15s，55℃复性30s，72℃延伸30s，24个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

6.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸亲缘关系鉴定方法，其特征在于，步骤4)中，10μLPCR扩增的体系为：75ng基因组DNA，1.0μL 10×PCR Buffer，1.2μL 2.5mM·L^-1MgCl，0.2μL10mM·L^-1dNTP，0.5μL 10μM·L^-1引物700左端引物，0.5μL 10μM·L^-1引物700右端引物和0.5个单位Taq酶，ddH₂O补足10μL，其中，引物700左端序列为：TATGGTATATTCTATTCGGTT；引物700右端序列为：TCATTCCAATTCTACCGAT。

7.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸亲缘关系鉴定方法，其特征在于，步骤4)中，采用Touch-downPCR扩增程序为：95℃预变性4min，94℃变性15s，58℃(△＝-1℃)复性30s，72℃延伸45s，6个循环；94℃变性15s，55℃复性30s，72℃延伸45s，24个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

8.权利要求1所述的杂交鹅掌楸亲缘关系鉴定方法的专用试剂盒，其特征在于，至少包括用量为1次以上的引物试剂，所述的引物试剂的引物序列为：引物18.2左端引物序列为：AATTCTCTCAATTTCACTTTGCCT；引物18.2右端引物序列为：TGGTCGATGCATTCTGTTTCT；引物700左端序列为：TATGGTATATTCTATTCGGTT；引物700右端序列为：TCATTCCAATTCTACCGAT。

9.根据权利要求8所述的专用试剂盒，其特征在于，还包括DNA标样试剂、DNA提取试剂、电泳试剂中的一种以上；所述的DNA标样至少包含242bp、382bp、400bp以及700bp四个条带。

10.权利要求8或9所述的专用试剂盒在杂交鹅掌楸亲缘关系鉴定中的应用。