[发明专利]一种转氨酶、突变体及其生产L-草铵膦的应用

说明书

本发明公开了一种转氨酶、突变体及其生产L‑草铵膦的应用，所述突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸第62位的异亮氨酸取代为缬氨酸、第74位的丝氨酸取代为苏氨酸、第93位的甲硫氨酸取代为异亮氨酸、第167位的酪氨酸取代为苯丙氨酸、第220位的丙氨酸取代为脯氨酸、第282位的精氨酸取代为赖氨酸、第353位的丙氨酸取代为丝氨酸、第355的异亮氨酸取代为缬氨酸。转氨酶以4‑(甲基羟基磷酰基)‑2‑羰基‑丁酸为底物制备L‑草铵膦，产物ee99.9％，4h底物转化率为56.31％。转氨酶突变体产物ee99.9％，4h底物转化率为95.42％。

(一)技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及到转氨酶序列荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens ZJB09-108)的基因，表达载体、基因工程菌及其在制备不对称手性胺化合物中的应用。

(二)背景技术

转氨酶(Amine Transaminase,ATA,EC2.6.1.X)属于转移酶类，是催化氨基供体上的氨基转移到潜手性的酮类化合物上，得到手性胺和副产物酮或者α-酮酸的一类酶，反应过程需要磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate,PLP)的参与，其催化的反应是可逆的。转氨酶广泛存在于自然界中并在细胞的氮代谢过程中发挥着重要的氨基转移作用。在一般情况下，所有的转氨酶都可根据在其可逆反应中所利用的氨基酸底物进行分类，根据其催化活力最大的氨基酸来命名，比如天冬氨酸转氨酶和苯丙氨酸转氨酶的氨基供体最适底物分别为天冬氨酸和苯丙氨酸；而根据氨基被转移到不同位置的氨基受体上，转氨酶又可以被分为α-转氨酶和ω-转氨酶。α-转氨酶需要一个α位置的羰基受体来发挥其催化功能，但转氨酶在原则上可以催化转化任何结构的酮和胺，因而具有更高的应用价值。ω-转氨酶反应过程可分为两步，第一步反应是在ω-转氨酶的作用下将氨基供体上的氨基转移到PLP的羰基上，从而形成5-磷酸吡哆胺(PMP)和与氨基供体对应的酮；第二步反应同样在ω-转氨酶的作用下将PMP上的氨基转移到氨基受体上，PMP又转变为PLP实现循环。

随着社会经济的不断发展，手性胺类化合物是非常重要的药物和药物中间体，在制药行业和农业、化工等方面发挥着越来越重要的作用，大量高纯度的手性化合物应用到其中。目前，手性胺类化合物的制备方法主要是化学合成和生物合成的方法。化学合成手性胺化合物虽然工艺和技术比较成熟，但其反应操作复杂，反应条件苛刻，产物收率和产物对映过量体ee值不高，而且容易造成环境的严重污染。相比较于化学合成方法，生物合成方法的显著优点在于它的理论产率可以达到100％，而且反应条件温和，成本较低，对环境污染小，可以制得大量的光学纯度较高的手性胺类化合物。随着重组DNA技术和基因合成等新兴技术的不断发展，一些用于生物催化的酶能够迅速的被识别和生产，并且可以得到更加稳定和有效的生物催化剂，正因这些先进技术的发展，为利用生物催化剂工业化合成手性胺类化合物的研究开辟了新的角度。特别是重组DNA技术促进了生物催化工艺学的发展。目前，利用酶催化不对称合成手性胺类化合物主要应用的是氨基脱氢酶和ω-转氨酶。ω-转氨酶不仅可应用于对外消旋体的拆分，还可以催化前体酮底物不对称合成手性胺类化合物，产物的光学纯度较高，制备手性胺类化合物范围较广，因此更具有应用价值。现在已经在多个种属的野生菌中发现了ω-转氨酶，其中包括弧菌(Vibrio fluvialis)、节杆菌(Arthrobacter sp.)、色杆菌(Chromobacterium violaceum)等。Koszeiewski等在利用ATA-117转化4-苯基-2-丁酮合成R-4-苯基丁-2-胺的过程中，综合运用有机溶剂DMSO萃取和调整pH的方法使反应物的转化率达到92％，ee值高达99％。Yun等利用能共同表达产生ω-转氨酶和乙酰乳酸合酶的基因重组菌Escherichia coli，以整细胞的形式催化苯乙酮不对称合成苯乙胺，通过在反应体系中加入乳酸脱氢酶，除去丙酮酸的方法改变反应的热力学平衡，同时又降低了产物抑制。在转氨酶和乳酸脱氢酶的共同作用下，4-苯基-2-丁酮转化成-4-苯基-2-丁胺，转化率达到99％，ee值大于99％。