[发明专利]一种利用响应面法结合遗传算法和直接搜索算法优化的丹栀逍遥散的提取方法

权利要求书

1.一种利用响应面法结合遗传算法和直接搜索算法优化的丹栀逍遥散的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）选择栀子苷、芍药苷和丹皮酚为指标成分，采用高效液相色谱法进行指标成分含量测定；

所述高效液相色谱的条件为：色谱柱：Phenomenex Luna-C₁₈色谱柱，250×4.60 mm，5μm；柱温：30℃；流动相：流动相 A为乙腈，B为0.1%体积比磷酸，进行梯度洗脱；检测波长：0~30 min内，检测波长为240 nm、30~65 min内，检测波长为232 nm、65~90 min内，检测波长为274 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；

所述梯度洗脱为：

；

（2）混合对照品溶液的制备：精密称定栀子苷、芍药苷及丹皮酚对照品，加适量甲醇制成终浓度分别为74.9、56.2及33.4 μg/mL的混合对照品溶液；

（3）供试品溶液的制备：分别精密称取过4号筛的柴胡0.5 g、当归0.5 g、茯苓0.5 g、白芍0.5 g、白术0.5 g、薄荷0.1 g、甘草0.4 g、牡丹皮0.75 g和栀子0.75 g药材粉末组成复方，按照液料比为5-30：1mL/g加入20-80%乙醇溶液，加热回流提取1-4次，提取时间为1.5-4h，提取液滤过后放冷、补足失重，离心，取1 mL上清液，用甲醇定容至10 mL容量瓶，微孔滤膜滤过后作为供试品溶液；

（4）标准曲线的建立：取混合对照品溶液，进行HPLC检测，分别进样1、2、4、6、8、10、20 μL，以质量浓度为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y）进行线性回归：栀子苷的回归方程为y=1483728x-12051，r=0.99995；芍药苷的回归方程为y=927308x-20630，r=0.9975；丹皮酚的回归方程为y=5116603x-44372，r=0.9999；

（5）实验设计与统计分析：①单因素试验：以乙醇浓度、水料比、提取时间及提取次数为参数进行单因素试验，取供试品溶液进高效液相色谱仪检测，分别测定丹栀逍遥散中栀子苷、芍药苷及丹皮酚指标成分的含量，并进行评分，评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再按照各指标的权重，将栀子苷、芍药苷和丹皮酚的权重系数定为相等，各占1/3，计算得综合评分，评分公式为：综合得分（Y）=（栀子苷含量/最高组栀子苷含量×1/3+芍药苷含量/最高组芍药苷含量×1/3+丹皮酚含量/最高组丹皮酚含量×1/3）×100；②BBD-响应面法优化分析：在单因素试验的基础上，使用软件Design-Expert 8.0.5b，以丹栀逍遥散中芍药苷、丹皮酚、栀子苷三成分的综合评分为响应值，选取提取过程中效果显著的乙醇浓度（A）、提取时间（B）和水料比（C）三因素为自变量，建立多元二次回归方程：Y=-15.11647+0.40285A+2.26667B+0.28386C-0.002425AB+0.00112AC-0.01620BC-0.00339175A²-0.30017B²-0.009597C²，r=0.991；

（6）遗传算法搜索分析：以BBD二项式拟合方程为目标函数，使用软件Matlab 2014b，采用遗传算法搜索丹栀逍遥散中指标成分的最佳提取条件，搜索过程使用遗传算法工具GUI，设置参数，随机搜索10次，验证分析；

（7）直接搜索法搜索分析：以二项式拟合方程为目标函数，使用软件Matlab 2014b，采用直接搜索算法搜索丹栀逍遥散中指标成分的最佳提取条件，搜索过程使用模式搜索工具GUI，设置参数，随机搜索10次，验证分析。