[发明专利]一种高表达胶原蛋白的脂肪干细胞的制备方法及其产品

权利要求书

1.一种高表达胶原蛋白的脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括通过使用重组人IV型胶原蛋白α3包被的细胞培养板或培养皿和重组人IV型胶原蛋白α3包被的细胞培养瓶，在重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维生长因子、维生素E和刺阿干树仁油的联合协同培养下，从脂肪中高表达胶原蛋白的脂肪干细胞的制备生长；

其中，所述脂肪干细胞培养14天可获得1×10⁹以上的脂肪干细胞，脂肪干细胞经流式细胞仪检测，高表达CD90+为≥95％、CD73+为≥95％和CD106+为≥95％，低表达CD34+为≤5％、CD45+为≤5％和CD14+为≤5％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组人IV型胶原蛋白α3包被的细胞培养器，为使用1μg-100μg/ml的重组人IV型胶原蛋白α3在4℃冰箱过夜或37℃孵育1小时后4℃冰箱过夜，在细胞培养板、培养皿或细胞培养瓶中进行包被；包被后吸除胶原蛋白液，在生物安全柜或超净台中通风干燥，干燥后保存在4℃冰箱备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子使用浓度为1-200ng/mL重组人表皮生长因子、1-200ng/m重组人碱性成纤维生长因子、1-500ng/mL维生素E、1-500ng/mL刺阿干树仁油。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞因子使用浓度，优选地为5-50ng/mL重组人表皮生长因子、5-50ng/m重组人碱性成纤维生长因子、10-100ng/mL维生素E和10-100ng/mL刺阿干树仁油。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，脂肪组织30mL，用生理盐水反复冲洗5次，尽量吸除脂肪中油及血细胞；

使用1∶1的质量体积比为0.25％的胰酶和质量体积比为0.1％的I型胶原酶20-50mL，在37℃培养箱中消化60分钟，每隔15分钟用漩涡振荡仪振荡2分钟；消化后1500rpm离心10分钟，吸弃上层油脂后加入生理盐水重悬，用100μm细胞筛过滤；细胞悬液1000rpm离心10分钟，细胞沉淀用生理盐水重悬洗涤2次后加入无血清培养液重悬，苔盘兰染色计数后按1-10×10⁶细胞/ml加入到重组人IV型胶原蛋白α3包被的细胞培养板或培养皿中培养，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24-72小时；

培养24-72小时后用5ml移液管吸弃培养液，加入新鲜无血清培养液进行换液，细胞培养板或培养皿继续放置37℃，5％CO₂培养箱中继续培养；

当脂肪干细胞生长融合达到80％以上时进行消化扩瓶，将培养液吸除，取pH值为7.4的1×PBS洗涤一次后加入0.5ml 0.25％胰酶到培养瓶中，消化2-3分钟后加入200μl胎牛血清终止消化，再加入生理盐水，用5mL移液管吹打，吸至15ml离心管中，再用生理盐水洗涤一次，加入到同一个15mL离心管中，1000转每分钟离心10分钟收集脂肪干细胞；离心后用1mL新鲜培养液重悬，计数，用5mL移液管加入10mL新鲜的无血清培养液，加入到1瓶胶原包被的培养瓶中继续在37℃，5％CO₂培养箱中培养，每隔2天换一次新鲜培养液；待脂肪干细胞生长融合达到80％以上时，按上述经胰酶消化收集脂肪干细胞，连续传代3代培养，获得10⁹以上的脂肪干细胞，用4ml生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得大量脂肪干细胞，放置4℃条件下保存备用；

部分脂肪干细胞在40％脂肪干细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用；

取苔盼兰染色计数后的3×10⁶脂肪干细胞，分三组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD90单抗、20μL PE标记鼠抗人CD106单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD34单抗；第二组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD73单抗、20μL PE标记鼠抗人CD45单抗和20μLPercp标记鼠抗人CD14单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μLPE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FC500流式细胞仪检测；脂肪干细胞高表达CD90+≥95％、CD106+≥95％和CD73+≥95％，低表达CD34+≤5％、CD45+≤5％和CD14+≤5％。