[发明专利]西瓜枯萎病菌RNAi组份FonDCL1基因缺失突变体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种西瓜枯萎病菌RNAi组份FonDCL1基因缺失突变体及其构建方法。本发明根据已有报道的Dicer like 1蛋白序列，同源比对Fon基因组序列，获得西瓜枯萎病菌FonDCL1基因，采用基因同源置换原理，利用Split‑marker策略，用潮霉素B(HPH)基因DNA片段替换目的基因FonDCL1，通过构建该基因同源重组片段，以野生菌株Fon1遗传转化获得FonDCL1的基因缺失突变体，该FonDCL1突变体具有对西瓜幼苗致病力增强，对莫能霉素钠、羟基脲、荧光增白剂CFW、刚果红CR及双氧水等非生物胁迫因子更加敏感等特性，这为Fon1参与自身生长发育及侵染西瓜过程中产生的小RNA的功能解析提供研究基础。

技术领域

本发明涉及一种西瓜枯萎病菌RNAi组份FonDCL1基因缺失突变体及其构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染引起的西瓜维管束系统病害，病原主要通过根部伤口或根毛顶端细胞间隙侵入，在寄主管壁细胞间和细胞内生长后，进入维管束，分解破坏细胞，使导管内积累果胶类物质，堵塞导管，影响水分运输，进而引起植株萎蔫。

西瓜枯萎病自幼苗至成株均可发病，以座瓜期和瓜膨大后期发病最重。幼苗受害，出苗前可造成烂种出土后发病，子叶、真叶呈失水状萎蔫，茎基部变褐收缩呈碎倒状，拔出苗子可见根部黄褐色腐烂。成株期受害，初期病株下部叶片失水萎蔫，茎蔓基部向上褪绿。后期病部呈棕褐色，发软，常纵裂，有胶状红色物质溢出。病株基部潮湿时，布满白色至粉红色霉状病原分生孢子，剖视茎基部至根部，可见维管束变黄褐色。

迄今，己发现西瓜枯萎病有个生理小种，即生理小种0、1、2和3，中国以生理小种1占优势。在农业生产中，枯萎病型尖孢镰刀菌除危害西瓜外，寄主范围广泛，可引起100多种植物维管束萎蔫病害，如川红花、甘蔗、芝麻、粉蕉、凤梨以及瓜类和豆类等多种植物，尤其对葫芦科植物、香蕉、番茄和棉花等高经济价值作物有严重危害作用。

西瓜枯萎病在我国各地西瓜栽培区均有发生，该病害可造成西瓜产量下降，甚至绝收。近年来西瓜栽培尤其是保护地面积迅速扩大，重茬连作面积增大，保护地高温高湿造成西瓜枯萎病越来越普遍，越来越严重，给西瓜产业造成巨大经济损失。

miRNA(microRNA)是一类长约22nt，具有调控功能的内源性非编码小RNA。miRNA参与机体中许多重要的生理及病理过程，如机体的生长发育、肿瘤的发生和免疫反应等，这使得其成为了生物学研究的焦点。Dicer蛋白是RNaseⅢ家族中重要的一员，对miRNA或siRNA的产生起着至关重要的作用。Dicer蛋白通常由1个DEXH盒子或H盒子、1个DUF283结构域、1个PAZ结构域、2个RNaseⅢ结构域(RNaseⅢa和RNaseⅢb)和1个dsRNA结合结构域组成。Dicer蛋白的分子结构决定了其在miRNAs合成中发挥着重要作用。

Dicer可以将pre-miRNA降解成特定长度，通常为21-25nt的短dsRNA片段。Dicer首先将pre-miRNA的3’端二核苷酸与其自身的PAZ结构域结合，然后利用“分子标尺”的结构在pre-miRNA固定位置进行切割，形成miRNA的5’端，Dicer对pre-miRNA的作用过程需要Mg²⁺，但又不结合Mg²⁺，其催化活性对离子强度敏感表明静电底物-酶相互作用对Dicer的功能是非常重要的。

在拟南芥中，在受到病毒侵染时，DCL4是拟南芥中Dicer抵抗病毒的第一道防线，DCL4可以产生小RNA抵御病毒。在DCL4不能发挥抵御活性时，DCL2就可以成为Dicer抵抗病毒的第二道防线。在水稻的Osdcl1的缺失突变体中，miRNA的数量会大量的减少，会最终影响水稻的发育，表明OsDcr1与水稻miRNA的加工过程有关，通过miRNA来调控水稻的生长发育。在果蝇中DCL1与miRNA的切割和miRISC复合物的产生有关。