[发明专利]西瓜枯萎病菌RNAi组份FonDCL1基因缺失突变体及其构建方法

权利要求书

1.一种西瓜枯萎病菌RNAi组份基因FonDCL1，其特征在于，包含其上、下游核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的一种西瓜枯萎病菌RNAi组份基因FonDCL1，其特征在于，所述上、下游核苷酸序列的长度均为3Kb。

3.根据权利要求1所述的一种西瓜枯萎病菌RNAi组份基因FonDCL1，其特征在于，与潮霉素抗性基因HPH发生替换的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.权利要求1或2所述西瓜枯萎病菌RNAi组份基因FonDCL1编码的cDNA，其特征在于，其具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

5.权利要求1或2所述西瓜枯萎病菌RNAi组份基因FonDCL1表达的蛋白质，其特征在于，其具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

6.一种西瓜枯萎病菌FonDCL1基因缺失突变体，其特征在于，通过以下方法获得：

1)FonDCL1基因缺失重组DNA片段构建

第一轮PCR扩增：以西瓜枯萎病基因组DNA为模板，引物Fon1DCL1-LBCK/Fon1DCL1-HPH-LB-R扩增FonDCL1基因上游FonDCL1-UP片段，引物Fon1DCL1-HPH-RB-F/Fon1DCL1-RBCK扩增FonDCL1基因下游FonDCL1-DOWN片段；以载体pCT74质粒DNA为模板，引物HYG-F/HYG-R扩增抗性基因HYG片段；

第二轮PCR扩增：以FonDCL1-UP和HYG为模板，引物Fon1DCL1-LB-F/HYG-R1扩增FonDCL1-UP+HY片段，以FonDCL1-DOWN和HYG为模板，引物HYG-F1/Fon1DCL1-RB-R扩增YG+FonDCL1-DOWN片段；

2)将原生质体与FonDCL1-UP+HY片段和YG+FonDCL1-DOWN片段混匀，进行FonDCL1基因缺失遗传转化，获得突变体；

所述引物Fon1DCL1-LBCK、Fon1DCL1-HPH-LB-R、Fon1DCL1-HPH-RB-F、Fon1DCL1-RBCK、HYG-F、HYG-R、Fon1DCL1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1、Fon1DCL1-RB-R的核苷酸序列依次如SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。

7.根据权利要求6所述的一种西瓜枯萎病菌FonDCL1基因缺失突变体，其特征在于，所述FonDCL1基因缺失突变体通过以下方法鉴定：

以转化子的基因组DNA为模板，设计四对引物用于鉴定FonDCL1基因缺失突变体，分别是上游引物Fon1DCL1-LBCK/HPT-LBCK，下游引物Fon1DCL1-RBCK/HPT-RBCK，用于扩增HYG基因的引物HYG-F/HYG-R，FonDCL1基因内部引物Fon1DCL1-2193/Fon1DCL1-3030；

所述引物HPT-LBCK、HPT-RBCK、Fon1DCL1-2193、Fon1DCL1-3030的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示。