[发明专利]ddx27基因缺失斑马鱼突变体的制备方法

说明书

本发明公开了一种斑马鱼ddx27基因缺失突变体的制备方法；包括如下步骤：确定ddx27基因敲除的靶点在斑马鱼ddx27基因第6个外显子上，设计gRNA序列；以pUC19‑‑gRNA scaffold质粒为模板，使用引物T7‑ddx27‑sfd、tracr rev进行PCR扩增；PCR产物纯化、体外转录获得gRNA；将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中，培养获得稳定遗传的ddx27基因突变体。另外，本发明还公开了ddx27基因缺失斑马鱼突变体的表型，对于研究其生物学功能有重要作用。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，获得ddx27基因缺失斑马鱼突变体的具体方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统属于细菌和古细菌的适应性免疫防御机制。它是在生物不断进化的过程中产生，用来保护自身基因组免受外源核酸的干扰。1987年大阪大学(OsakaUniversity)的研究人员在Escherichia coli K12的碱性磷酸酶基因附近发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeat,CRISPR)和CRISPR相关基因(CRISPR-associated genes,Cas gene)。CRISPR RNA(crRNA)以碱基互补的形式引导Cas蛋白识别入侵的外源基因组，并对其DNA进行剪切。根据Cas蛋白的序列和结构将CRISPR/Cas系统分为I型、II型和III型。I和II型CRISPR-Cas系统可以降解外源DNA，而III型CRISPR-Cas系统不仅可以降解外源DNA，还可以降解外源RNA。另外，I和III型CRISPR-Cas系统介导的外源核酸的降解需要多种Cas蛋白共同参与，而II型CRISPR-Cas系统则只需要一个单一的Cas9蛋白，它的这一特点，使得II型Cas9迅速在生物学领域得到了广泛的应用。II型CRISPR/Cas系统即CRISPR/Cas9系统，已被发展成为一套理想的程序化的基因编辑工具。Cas9介导的基因编辑依赖两个连续的步骤：首先，Cas9核酸内切酶在crRNA的介导下对基因组DNA进行剪切；然后，DNA的DSB会被细胞内天然的DNA修复系统进行修复。

相比于传统的基因编辑技术，CRISPR/Cas9具有更高效率，更方便操作，具有以下优点：

1.只需要合成一个gRNA即可实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具有特异性，

2.编码gRNA的序列不超过150bp,便于构建，

3.较短的gRNA序列也避免了超长编码载体对机体造成的不良影响。

已有研究显示DExD/H-box家族作为RNA解旋酶超家族成员之一参与RNA代谢的各个方面。它们存在于利用RNA解旋酶或核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)酶的大多数生物体中。在细胞内该酶能水解核苷三磷酸(nucleotide triphosphate，NTP)，与其他蛋白组成复合体发挥作用。DExD/H-box家族在几乎所有涉及RNA的细胞进程中发挥重要作用，如基因转录、mRNA前体剪接、mRNA输出、核糖体生成、翻译起始、细胞器基因表达、RNA降解等，影响RNA的生成及RNA的多态性，但是这些酶在体内的性质以及具体的功能研究仍较少描述。

已有报道多集中于临床肿瘤病例分析，DDX27高表达于癌变组织，促进细胞增殖以及集落形成，由此可作为潜在的治疗药物靶点。本发明利用斑马鱼这一模式生物，通过CRISPR/Cas9技术对其基因组进行基因编辑，实现目的基因的定位敲除，从而获得ddx27基因突变体，这将为后续的分子机制研究以及疾病建模方面的应用提供基础支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种ddx27基因缺失斑马鱼突变体的制备方法；本发明设计了新的gRNA靶点序列，设计在ddx27第六个外显子上，gRNA靶点序列为：GGACAGATTCATGTCCTGGA，从而对ddx27基因进行了敲除。