[发明专利]ddx27基因缺失斑马鱼突变体的制备方法

权利要求书

1.一种斑马鱼ddx27基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、确定ddx27基因敲除的靶点在斑马鱼ddx27基因第6个外显子上设计gRNA序列；所述靶点序列为如SEQ ID NO.1所示的序列；所述gRNA的序列为如SEQ ID NO.6所示的序列；

S2、设计合成gRNA的上游引物T7-ddx27-sfd、下游引物tracrrev；

S3、以pUC19-gRNAscaffold质粒为模板，使用引物T7-ddx27-sfd、tracrrev进行PCR扩增；所述引物T7-ddx27-sfd的序列为如SEQ ID NO.2所示的序列；所述引物tracr rev的序列为如SEQ ID NO.3所示的序列；

S4、对步骤S3的PCR产物进行体外转录，转化获得gRNA；

S5、将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中；

S6、培养获得稳定遗传的斑马鱼ddx27基因突变体；具体包括如下步骤：

A1、分别取导入gRNA与Cas9蛋白的斑马鱼以及野生型未注射的斑马鱼胚胎进行ddx27基因敲除效率的检测，确定ddx27基因敲除阳性的F₀养至成鱼；

A2、将ddx27基因敲除阳性F₀成鱼与野生型斑马鱼外交，进行可遗传性及有效突变检测，筛选可遗传的有效突变F1进行喂养至成鱼；经基因型鉴定获得ddx27F₁突变体斑马鱼；

A3、将相同突变的ddx27F₁突变体斑马鱼内交，获得ddx27F₂突变体斑马鱼；

A4、鉴定为F₂代中ddx27基因敲除的纯合子即所述稳定遗传的斑马鱼ddx27基因突变体；

获得的ddx27-/-突变体斑马鱼具有发育迟缓、畸形的明显表型；所述发育迟缓、畸形包括小头、小眼、心包水肿。

2.根据权利要求1所述的斑马鱼ddx27基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤S5中，将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼具体为：将gRNA与Cas9蛋白混合，显微注射到斑马鱼一细胞期胚胎中；其中，gRNA终浓度为80-100ng/μL，Cas9蛋白终浓度为800ng/μL；总体积V＝1μL。

3.根据权利要求1所述的斑马鱼ddx27基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤A1中，ddx27基因敲除检测采用的引物序列包括如SEQ ID NO.4所示的序列的上游引物ddx27-F和如SEQ ID NO.5所示的序列的下游引物ddx27-R。