[发明专利]一种重组质粒pET28a-Ag43、表面展示质粒、重组工程菌及其应用

说明书

本发明提供了一种重组质粒pET28a‑Ag43、表面展示质粒、重组工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。所述重组质粒pET28a‑Ag43，自转运蛋白Ag43编码基因插入到质粒pET28a的EcoRI和HindIII多克隆位点处；所述自转运蛋白Ag43编码基因具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。外源蛋白基因片段可以通过双酶切方式快速连接至重组质粒的多克隆位点，构建重组工程菌，实现外源蛋白在细胞表面展示表达，不需要破壁释放胞内蛋白酶，同时酶蛋白固定到细胞表面，方便酶蛋白的回收和重复利用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组质粒pET28a-Ag43、表面展示质粒、重组工程菌及其应用。

背景技术

细胞表面展示技术是指通过锚定蛋白与外源蛋白融合表达，借助锚定蛋白可结合到细胞外膜的特性将自转运蛋白携带到细胞的表面，一方面克服了因为细胞膜的阻隔而造成底物和酶蛋白无法接触的困难，提高了底物与酶的反应效率，另一方面，细胞表面展示大大地简化了酶蛋白纯化和回收再利用的过程。因此，细胞表面展示可广泛应用于构建蛋白质筛选文库、抗体疫苗开发、全细胞催化和环境修复。

但由于目前没有通用的可商业化的质粒使用，极大的限制了细胞表面展示技术在生产的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种重组质粒pET28a-Ag43、表面展示质粒、重组工程菌及其应用，能够使外源蛋白在工程菌表面展示且具有高效的表达率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种重组质粒pET28a-Ag43，自转运蛋白Ag43编码基因插入到质粒pET28a的EcoRI和HindIII多克隆位点处；

所述自转运蛋白Ag43编码基因具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种上述方案所述重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

1)采用EcoRI和HindIII分别对质粒pET28a和Ag43编码基因进行双酶切，得到酶切后的pET28a和酶切后的Ag43编码基因；

2)将所述步骤1)的酶切后的pET28a和酶切后的Ag43编码基因连接，得到重组质粒pET28a-Ag43。

优选的，所述步骤1)中Ag43编码基因的制备方法包括如下步骤：

a.将大肠杆菌K-12 MG1655进行扩大培养，得到大肠杆菌K-12 MG1655菌体；

b.提取所述步骤a的大肠杆菌K-12 MG1655的总DNA；

c.以所述步骤b中大肠杆菌K-12 MG1655的总DNA为模板，采用引物Ag43-EcoRI-F和Ag43 -HindIII-R扩增Ag43编码基因，得到Ag43编码基因；

所述引物Ag43-EcoRI-F具有序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

所述引物Ag43 -HindIII-R具有序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

优选的，所述步骤c中Ag43-EcoRI-F和Ag43 -HindIII-R扩增的体系为：基因组DNA或者质粒DNA10～100ng，前端引物2～3μL，后端引物2～3μL，dNTP混合物1～3μL，10×ExTaq缓冲液5μL，Ex Taq聚合酶0.5μL，总体系为50μL；

所述前端引物的浓度为10μmol/L；所述后端引物的浓度为10μmol/L；所述dNTP混合物的浓度为10μmol/L。