[发明专利]一种重组β-葡糖苷酶及其表达纯化方法和固定化应用

说明书

本发明涉及一种重组β‑葡糖苷酶及其表达纯化方法和固定化应用，属于生物酶工程技术领域；所述重组β‑葡萄糖苷酶是用通用连接肽linker连接二元标签ELP、GB和β‑葡萄糖苷酶（Glu）得到的重组β‑葡萄糖苷酶Glu‑linker‑ELP‑GB（GLEGB），其中，GB多肽的序列连接在ELP基因的的3’端；本发明利用重组酶上的ELP标签的可逆相变特性可以实现酶分离纯化，只需加入一定量的(HN4)2SO4孵育一段时间即可使含有ELP标签的重组酶沉淀下来，利用ELP标签的温度响应行为，实现目标酶分子的一步快速分离纯化，该方法纯化酶的效果优于硫酸铵沉淀法，同时，纯化成本远远低于色谱法。

技术领域

本发明涉及一种重组β-葡糖苷酶及其表达纯化方法和固定化应用，属于生物酶工程技术领域。

背景技术

酶是一类能在温和条件下催化化学反应的蛋白质，具有高底物特异性、高产物特异性和高催化效率等特点。在酶的生产和应用过程中，主要存在如下问题：第一，酶的分离纯化过程复杂，造成酶的生产成本昂贵，酶活损失大，需要开发简单高效的分离纯化酶的方法；第二，酶的应用成本高，为了提高酶反应过程效率和降低生产成本，酶的固定化技术的开发也是酶工程研究领域的热点。目前，对于酶的生产，分离纯化和催化应用过程普遍缺乏集成化的方法。

ELP（elastin-like polypeptides，类弹性蛋白）是一种人工合成的多肽聚合物，主要由五肽重复序列单元Val-Pro-Gly-Xaa-Gly串联组成，其中Xaa称为“客座氨基酸”，可以是除了Pro以外的任意一种氨基酸。ELP具有依赖于自身的序列、盐度、温度敏感性的可逆相变过程。基于ELP的可逆相变特性，使用ELP作为纯化标签纯化蛋白的方法被称为ITC（Inverse Transition Cycling）法，ITC纯化融合蛋白的方法是一种新型、发展潜力大、应用前景广的非色谱纯化技术，而且具有回收率高、操作简单、可对目标蛋白浓缩富集等优势，该技术可作为一种新的纯化方法代替传统的色谱等传统的蛋白纯化方法。但是，由于ELPs的分子量往往较大，对融合后的蛋白活性可能会产生影响，而且相变温度的影响因素也很多，且需要多次ITC才能得到较纯的目的蛋白。

为了提高酶的利用率，实现酶的重复循环催化，通过物理吸附的固定化酶具有操作简单，材料较为简单，将酶从材料上再次洗脱下来较为方便，但是物理吸附法的效果不稳定，酶分子会由于吸附力较弱而从载体上脱落下来，重复使用能力较差。Graphene binding（GB）多肽（His-Asn-Trp-Tyr-His-Trp-Trp-Pro-His）由于具有较多疏水性的氨基酸残基，可以和大部分疏水性的材料产生较强的吸附力。目前有关GB多肽的报道很少，主要集中在用它修饰一些多肽的末端，使其能够与疏水性的材料进行结合。

发明内容

本发明的主要目的是克服现有酶工程技术中存在的缺陷，提供一种新型的重组β-葡糖苷酶及其表达纯化方法和固定化应用。

本发明采取的技术手段如下：

本发明首先提供一种重组β-葡萄糖苷酶，所述重组β-葡萄糖苷酶是用通用连接肽linker连接二元标签ELP、GB和β-葡萄糖苷酶（Glu）得到的重组β-葡萄糖苷酶Glu-linker-ELP-GB（GLEGB），得到的重组酶可以利用GB标签的疏水性固定在碳材料上。

本发明还提供所述重组β-葡萄糖苷酶的表达纯化方法，具体包括以下步骤：

（1）重组酶Glu-linker-ELP-GB的原核表达：