[发明专利]一种重组β-葡糖苷酶及其表达纯化方法和固定化应用

权利要求书

1.一种重组β-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述重组β-葡萄糖苷酶是用通用连接肽linker连接二元标签ELP、氧化石墨烯GB多肽和β-葡萄糖苷酶得到的重组β-葡萄糖苷酶Glu-linker-ELP-GB，其中，GB多肽的序列连接在ELP基因的的3’端；所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，连接肽linker的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，ELP的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，GB多肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

2.权利要求1所述的重组β-葡萄糖苷酶的表达纯化方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）重组酶Glu-linker-ELP-GB的原核表达：

所述重组β-葡萄糖苷酶是用通用连接肽linker连接二元标签ELP、GB和β-葡萄糖苷酶，然后采用T7表达系统，以pET28a为载体，合成重组酶的DNA，将其与空载体连接得到重组质粒pET-Glu-linker-ELP-GB (pET-GLEGB)；

将验证成功的重组质粒转入到大肠杆菌感受态中，将挑选的单克隆菌株在LB 培养基中培养一段时间活化后，按照1%的比例分别转接至LB液体培养基中扩大培养，冰上静置一段时间后，加入一定量的IPTG诱导剂，在恒温振荡培养箱内继续培养，一段时间后于低温离心机离心后，弃上清，收集菌体，菌体用Tris-HCl缓冲液洗涤以去除残留的LB培养基，保存在冰箱中备用；

（2）重组酶Glu-linker-ELP-GB的分离纯化：

收集菌体在超声波细胞破碎仪上进行超声破碎，将培养基收集到的菌体洗涤后加入一定量预冷的Tri-HCl 缓冲液重悬均匀，再加入终浓度为1 mM 蛋白酶抑制剂；在细菌超声破碎仪内进行破碎，整个反应在冰水浴条件下进行；超声结束后，样品在低温离心机内离心一段时间，移出上清液至新的离心管中，再将上清离心，保证上清和沉淀分离；向分离后的粗酶液上清中加入一定量的(NH₄)₂SO₄放置在恒温振荡培养中振荡一段时间后离心，分离沉淀和上清；向沉淀中加入预冷的Tris-HCl 缓冲液重悬沉淀，将其放置在4℃恒温振荡培养箱内振荡一段时间后在离心机内离心；将上清液移至新的离心管内，该离心管内的溶液即为纯化后的重组酶Glu-linker-ELP-GB。

3.根据权利要求2所述的重组β-葡萄糖苷酶的表达纯化方法，其特征在于，步骤（1）中所述的ELP为N个五肽重复序列单元Val-Pro-Gly-Val-Gly串联组成，其中五肽重复序列个数N为20 – 80。

4.根据权利要求2所述的重组β-葡萄糖苷酶的表达纯化方法，其特征在于，步骤（1）中所述的单克隆菌株的活化时间为10 - 12 h；

所述扩大培养时，培养基的吸光度摇至OD600 0.4-0.6；

培养基在冰上静置的时间为20 - 40 min。

5.根据权利要求2所述的重组β-葡萄糖苷酶的表达纯化方法，其特征在于，步骤（1）中所述诱导剂IPTG加入的终浓度为0.2 - 0.4 mM；

所述加入诱导剂后在恒温振荡培养箱的温度为15 - 25 ℃，振荡条件为190 rpm。

6.根据权利要求2所述的重组β-葡萄糖苷酶的表达纯化方法，其特征在于，步骤（2）中所述加入预冷的Tris-HCl缓冲液的量为每100 mL培养基收集到的菌体加缓冲液 5 - 10mL。

7.根据权利要求2所述的重组β-葡萄糖苷酶的表达纯化方法，其特征在于，步骤（2）中所述超声破碎的破碎条件为：破碎功率100 - 300 W，连续破碎时间为5 - 10 s，破碎间歇时间5 - 10 s，超声破碎总时间不超过30min；破碎后离心的时间为10 - 20 min。