[发明专利]一种提高阿维菌素产量的方法及生产菌株

说明书

本发明提供一种提高阿维菌素产量的方法及生产菌株，本发明是在阿维链霉菌中，构建甲基丙二酰辅酶A表位酶(methylmalonyl‑CoA epimerase)编码基因mce(SAV2857)的过表达基因工程菌株。本发明得到的基因工程菌可直接用于阿维菌素的发酵生产，提高阿维菌素的发酵单位，阿维菌素B1a产量比出发菌株提高25％左右，降低生产成本，具有重要的工业应用前景。

技术领域

本发明属于微生物基因工程和发酵工程技术领域，具体地说，涉及一种基因工程方法构建得到的重组菌株，以及该菌株在提高阿维菌素产量中的应用。

背景技术

阿维菌素(avermectins)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的一类十六元环大环内酯类抗生素，可以用作杀灭节肢动物类寄生虫和线虫,具有高效、低毒、无残留等优点,被广泛应用于农业、医药和畜牧业等领域。阿维菌素由八个组分(A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b)组成，其中B1组分的杀虫活性最强，商业化的阿维菌素是B1组分。伊维菌素(ivermectin)是以阿维菌素B1为原料在C22-C23位加氢还原而成，与阿维菌素B1具有相同的杀虫活性，但毒性比阿维菌素低2-3倍，更适用于动物体内外寄生虫的防治。阿维菌素和伊维菌素具有独特的作用机制，不易使害虫产生抗性，且易降解、无残留，对作物、牲畜、人类和环境高度安全，被我国农业部推荐为无公害农药，具有非常广阔的市场前景和应用价值。阿维菌素和伊维菌素已在国内实现了产业化，取得了巨大的经济和社会效益。因此，通过基因工程手段改造阿维链霉菌以进一步提高阿维菌素的单位产量，降低生产成本，具有重要的现实意义。

阿维菌素的聚酮骨架是由一个支链脂肪酸依次加入七个乙酸盐和五个丙酸盐生成，a组分的起始支链脂肪酸为2-甲基丁酰基，是由L-异亮氨酸经脱氨、转氨、脱羧生成，b组分的起始支链脂肪酸为异丁酰基，由L-缬氨酸生成。目前我国阿维菌素的生产菌株还存在着发酵单位不高，生产成本高等问题。进一步提高阿维菌素的产量，降低生产成本，具有重要的现实意义。因此，通过基因工程手段改造阿维链霉菌以提高阿维菌素的产量，具有重要的意义和应用价值。在阿维菌素的生物合成中，丙二酰辅酶A为其提供乙酸盐前体，(S)-甲基丙二酰辅酶A能为其提供丙酸盐前体。mce编码甲基丙二酰辅酶A表位酶(methylmalonyl-CoA epimerase)，该酶催化(R)-甲基丙二酰CoA和(S)-甲基丙二酰CoA的互换。在表达聚酮合酶6-脱氧红霉内酯B合成酶(6-deoxyerythronolide B synthase)的大肠杆菌中同时过表达来自于谢氏丙酸杆菌的甲基丙二酰-CoA变位酶和来自天蓝色链霉菌的甲基丙二酰辅酶A表位酶,能促进大肠杆菌合成聚酮化合物6-脱氧红霉内酯B(Linda C.Dayem,JohnR.Carney,Daniel V.Santi,Blaine A.Pfeifer,Chaitan Khosla,and,and JamesT.Kealey.Metabolic engineering of a methylmalonyl-CoA mutase-epimerasepathway for complex polyketide biosynthesis in Escherichia coli.Biochemistry200241(16),5193-5201)。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高阿维菌素产量的方法。

本发明的另一目的是提供高产阿维菌素的基因工程菌。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种产阿维菌素的基因工程菌，其为过表达mce基因的菌株。

上述基因工程菌，所述mce基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示或如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

所述过表达mce基因的菌株为采用链霉菌强启动子过表达mce基因的菌株。