[发明专利]一种基于驼源抗PPRV cDNA文库及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种基于驼源抗PPRV cDNA文库，其特征在于：cDNA文库中存在具有中和活性抗小反刍兽疫病毒VHH抗体。

2.根据权利要求1所述的基于驼源抗PPRV cDNA文库，其特征在于：文库库容2.0ｘ10⁶cfu/mL，长度分布范围为400bp～2kbp，平均长度大于1Kbp，重组率 100%。

3.一种如权利要求1或2所述的基于驼源抗PPRV cDNA文库的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

步骤A：通过小反刍兽疫免疫骆驼程序获得免疫血清；

步骤B：根据血清抗体效价检测免疫血清，骆驼免疫合格后，采集免疫骆驼全血加抗凝剂，摇匀，稀释后将其加入骆驼淋巴细胞分离液得到分离骆驼外周血的淋巴细胞，从中提取Total RNA，分离、纯化mRNA ；

步骤C：利用两端分别带有SfiIA、SfiIB酶切位点引物逆转录外周血淋巴细胞提取的总mRNA，合成全长cDNA第一链，扩增，SfiI单酶切后定向插入特定载体 pGADT7-SfiI vector，获得基于驼源抗PPRV cDNA文库；

步骤C中，合成全长cDNA 具体过程为：在 PCR扩增管中依次加入下列组分：mRNA 、带有酶切位点GGCCATTACGGCC SMART引物、带有酶切位点GGCCGCCTCGGCC CDS引物，点击混匀，置于72℃金属浴，孵育2min，立即置冰上，冷却2min，点击收集；依次加入5X First strandBuffer、 DTT、dNTP Mix、 MMLV逆转录酶，点击混匀，置于42℃金属浴，反转录1h，室温冷却，加入RNA酶抑制剂，即得到产物为全长cDNA；

步骤C中，选用Advantage ®2 PCR Kit 进行双链扩增：1uL全长cDNA 100ng/uL、40uLddH₂O 、5uL 10X Advantage 2 PCR buffer， SMART引物1uL、CDS引物1uL、50X dNTP Mix1uL、50X Advantage2 polymerase Mix 1uL；扩增程序: 95℃ 1min，95℃ 30s ，68℃3min，25-30cycles每个循环延伸时间增加5s，68℃ 3min，得双链cDNA；

步骤C中，利用限制性内切酶SfiI对cDNA和pGADT7-SfiI载体进行酶切处理，使用CHROMA SPIN-1000-TE对酶切后cDNA进行过柱处理，去除短片段，经PCI/CI净化处理、乙醇精制、ddH₂O溶出，最后用DNA ligation Kit将GADT7-SfiI vector与过柱后cDNA， 12℃连接，对获得的连接液纯化精制，得到初级cDNA文库。

4.根据权利要求3所述的一种基于驼源抗PPRV cDNA文库的制备方法，其特征在于：步骤A中，小反刍兽疫免疫骆驼程序为：骆驼左前腿三角肌皮内注射2.5x10⁵ cfu的卡介苗，右侧颈部皮下注射羊3头份PPRV弱毒苗进行首免、2w采血并免疫浓缩、纯化细胞培养的弱毒苗，2月后进行三免，方式同二免。

5.根据权利要求4所述的一种基于驼源抗PPRV cDNA文库的制备方法，其特征在于：步骤B中，免疫后血清抗体效价为：空白对照OD₄₅₀=0.055、阴性对照OD₄₅₀=0.059、阳性对照OD₄₅₀=2.340、未免疫血清OD₄₅₀=0.065、一免血清效价1:40、二免血清效价1:2560、三免后血清效价1:16000；采集第三次免疫骆驼全血抗凝血，分离外周血淋巴细胞，提取Total RNA的浓度为5162ng/uL，R值为1.97，纯化mRNA poly(A)的浓度为251ng/uL，R值为1.98。

6.根据权利要求 1或2所述的一种基于驼源抗PPRV cDNA文库在筛选抗PPRV VHH抗体中的用途。

7.根据权利要求6所述的一种基于驼源抗PPRV cDNA文库，其特征在于：所述抗PPRVVHH抗体cDNA文库采用下述方法进行验证：培养细胞弱毒苗，浓缩、纯化后，与cDNA文库进行免疫印迹反应。