[发明专利]一种核酸适体生物传感器及其制备与应用

说明书

本发明公开了一种核酸适体生物传感器及在检测内毒素中的应用，所述传感器以金电极为基底，在基底表面自组装3～巯基丙酸，然后再在3～巯基丙酸上偶联氨基修饰的核酸适体。本发明有益效果主要体现在：本发明构建的核酸适体生物传感器用于细菌内毒素检测，构建简易，特异性高，检测限低，灵敏度达0.001EU/mL。所述细菌内毒素核酸适体生物传感器具有制备方便简单，易于操作，灵敏度高，检测限低等特点，可以进一步提高生物传感器的稳定性，进而使其具有广泛的应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种核酸适体内毒素电化学生物传感器的制备，属于生物技术领域，特别是生物传感器领域。

(二)背景技术

细菌内毒素在1892-1895年由Richard Pfeiffer从热灭活的霍乱弧菌(Vihriocholerae)溶解物中发现。内毒素的主要成分是脂多糖(LPS)，脂多糖又包括菌体多糖、核心多糖和类脂A(Lipid A)。类脂A是内毒素的主要活性成分，一种特殊的糖磷脂，是一种强免疫刺激因子，进入机体后作用于巨噬细胞，促使巨噬细胞产生多种细胞因子，引起发热，并造成心跳过速、休克、多器官功能衰竭等并发症甚至死亡。对机体的致热效应在临床上最为常见，内毒素致热非常敏感，作为外源性致热源，可引起内源性发热，同时它又可激活单核细胞，释放单核细胞因子形成内源性致热源，引起机体发热，中国药典对内毒素限量有着非常严格的规定，其中鞘内注射剂为0.2EU，放射性药品注射剂为2.5EU，每单位体重注射剂为5EU。因此检测和分离非肠道用药品尤其是注射针剂中的细菌内毒素成了生产工艺中的重要环节。近年来国内外报道革兰阴性菌感染有逐年增长的趋势，而内毒素作为革兰阴性菌的细胞壁结构成分，可使机体出现许多病理情况，因此建立一种能够对内毒素特异、灵敏的检测手段非常必要。上世纪90年代末期我国对生物传感器的研究开始发展，解决了材料的固定化技术、信号处理的电子技术，研发了一系列反应精确的分子装置，为生物传感器技术奠定了良好的技术基础。随着核酸适体作为生物传感器的敏感元件的优势越来越明显，基于核酸适体的生物传感器也成为国内外的研究热点。生物传感器所建立的分析方法主要包括两个大类，即光学检测和电化学检测。其中电化学分析技术作为一种灵敏度高、所需药品少、操作简单、便携和能在体检测等优点的检测手段，已经非常广泛的应用于生物传感器中，将其与核酸适体相结合构建新一代核酸适体电化学传感器，已成为分析与生命学科交叉研究的重要研究领域之一。基于核酸适体的电化学生物传感器结合了适配体与电化学分析两方面的优点，能将微小环境的变化转化为可测的电信号，对细菌内毒素进行定性定量分析，弥补了当前内毒素检测操作复杂、耗时长、检测范围窄等缺陷。

本发明选择金电极表面作为生物传感器的基底层，以3-巯基丙酸(3-Mercaptopropionic acid，简称MPA)为中间连接物，将氨基修饰的核酸适体固定到金电极表面，制备了一种核酸适体电化学生物传感器用于细菌内毒素的检测。

(三)发明内容

本发明涉及一种核酸适体内毒素电化学生物传感器的制备，具有灵敏度高、检测限低、易于操作等优点。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种核酸适体生物传感器，所述传感器以金电极为基底，在基底表面自组装3～巯基丙酸，然后再在3～巯基丙酸上偶联氨基修饰的核酸适体。

进一步，所述金电极先经过清洗处理再用作基底，所述清洗方法为：将金电极依次采用粒径为1.00μm、0.30μm和0.05μm氧化铝粉打磨抛光，用二次去离子水将金电极表面清洗干净后，再分别用无水乙醇和二次去离子水将电极超声(40KHz)清洗两次，每次5min；将二次去离子水超声后的金电极吹干后置于0.2-0.5M的H₂SO₄水溶液中，在电压0-1.6V、扫描速度100mV/s的条件下进行循环伏安扫描，直到循环伏安曲线稳定，取出金电极用二次去离子水冲洗去掉电极上残留的H₂SO₄，吹干后，获得清洗后的金电极。