[发明专利]一种含有EGFP基因的慢病毒载体及其构建方法

说明书

本发明属于慢病毒载体构建技术领域，具体涉及一种含有EGFP基因的慢病毒载体及其构建方法。所述慢病毒载体包括EGFP基因序列、慢病毒载体pLKO.1‐puro的基本序列、AgeI酶切位点、Eco RI酶切位点。所述制备方法为首先制备获得EGFP基因，将EGFP基因亚克隆到pLKO.1‐Puro慢病毒载体上，制备获得pLKO.1‐puro‐EGFP慢病毒载体。本发明构建获得的pLKO.1‐puro‐EGFP慢病毒载体可以广泛地应于到神经系统来源的细胞的实验研究，以克服神经系统来源的细胞用化学转染效率不高的问题。

技术领域

本发明属于慢病毒载体构建技术领域，具体涉及一种含有EGFP基因的慢病毒载体及其构建方法。

背景技术

由于慢病毒的感染效率很高，对一些难于进行转染的哺乳动物的细胞系来说，譬如原代培养的神经元来说，是一种十分有效的手段。神经系统来源的细胞系，如U87MG细胞，在通常的情况下，其化学转染的效率不是很高，从而对有些实验不能达到预期的目的，尤其是在基因水平上对目的基因的干预，不能收到预期的效果。电转染的效果要比化学转染好一些，但是实验的条件要经过反复摸索，而且细胞的死亡，如同化学转染一样，是无法控制的，大部分的细胞在转染/或电击以后发生死亡，从根本上影响了实验的进行。所以对于如神经系统来源的难转染的细胞来说，病毒感染目前是一种效率比较高，而且操作简便的方法。

在以病毒为载体对细胞进行感染，将外源性基因导入细胞内，以达到基因干扰，对靶基因进行操作方面，目前最常用的有腺病毒，逆转录病毒和慢病毒三种，但这三种病毒各有其利弊。早期使用的腺病毒系统，不能整合至靶细胞的基因组，只能瞬时表达，更为致命的是腺病毒的某些抗原表达，也很容易引起人体的免疫反应，所以在使用上有一定的局限性。反转录病毒载体是常用的病毒载体之一，是由具有感染性的小鼠的白血病病毒改造而来，能将非病毒基因导入细胞体内或体外进行有丝分裂。这些载体能产生病毒基因组的单一拷贝并高效准确地整和到宿主染色体的感染，但逆转录病毒只能感染分裂细胞，而且还存在有致癌的危险。相比之下，慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在国外已经开展了广泛的临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景的。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种含有EGFP基因的慢病毒载体及其制备方法。构建获得的pLKO.1‐puro‐EGFP慢病毒载体可以广泛地应于到神经系统来源的细胞的实验研究，以克服神经系统来源的细胞用化学转染效率不高的问题。该慢病毒载体含有EGFP荧光蛋白，可以更直观地在荧光显微镜下观察，使得未来的有关实验更为简便和直观。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种含有EGFP基因的慢病毒载体，所述慢病毒载体包括EGFP基因序列、慢病毒载体pLKO.1‐puro的基本序列、AgeI酶切位点、Eco RI酶切位点。

进一步地，所述慢病毒载体还包括抗性基因，优选氨苄抗性基因；

一种含有EGFP基因的慢病毒载体的制备方法，首先制备获得EGFP基因，将EGFP基因亚克隆到pLKO.1‐Puro慢病毒载体上，制备获得pLKO.1‐puro‐EGFP慢病毒载体。

进一步地，通过对pEGFP‐C1载体进行双酶切，制备获得EGFP基因。

进一步地，EGFP基因的制备具体为：利用AgeI和Eco RI对pEGFP‐C1载体进行双酶切，获得EGFP基因。