[发明专利]一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法和应用

说明书

本发明属于鱼类精子冷冻保存技术领域，具体公开了一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法和应用。利用该方法对泥鳅的精子进行超低温（‑196℃）冷冻保存，复苏后的精子活率达72.3%。用复苏后的精子对泥鳅卵受精，受精率达81.5%，孵化率达84.9%，与鲜精没有显著性差异（P＞0.05）。本方法冻存量大、效果好、简便易行、无需昂贵的仪器设备，能解决实际生产中泥鳅雄性个体少、精卵适时受精等问题，为泥鳅苗种的规模化生产和遗传育种研究提供便利。

技术领域

本发明属于鱼类精子冷冻保存技术领域，具体涉及一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法和应用。

背景技术

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)以其丰富的营养价值和特有的滋补药用功效而被誉为“水中人参”，深受中国、日本及韩国等地消费者的青睐，是我国新兴起的小型经济鱼类。随着泥鳅养殖业的发展，苗种的需求量与日俱增，特别是人工繁殖的优质苗种紧缺，不能满足市场需求，为此不少学者对泥鳅的人工繁殖进行了研究。然而，在实际生产中人们发现，雄性泥鳅个体小、数量也明显少于雌性泥鳅，这给泥鳅苗种的规模化人工繁殖带来不便。

人工保存精子不仅能不间断地为鱼类的规模化苗种繁殖提供配子材料，还能为鱼类的遗传育种研究提供便利。鉴于此，多年来，国内外学者对各种鱼类精液的保存方法进行了大量研究，并取得了一定成功。在泥鳅中，董德孝(2013)和陈金辉&文媛(2016)分别发明了在常温下保存泥鳅精子的方法及相应的保存液，但在常温条件下，通过加入保存液虽然能抑制精子的运动、延长精子的存活时间，但精子的代谢活动并没有完全停止，能量仍在消耗，因此，保存的时间非常有限。在超低温(-196℃)条件下，精子的运动和代谢活动完全停止，精子处于假死状态，但其结构完整，生命以静止状态保存下来，因此是目前长期、有效保存鱼类精子的唯一方法。陈兵(1991)以KCl、葡萄糖、NaHCO₃及NaCl为原料制备了大鳞副泥鳅精子冷冻保存的稀释液，并以7.5％的二甲亚砜(DMSO)为抗冻剂，对大鳞副泥鳅的精液进行超低温保存，但复苏后，大鳞副泥鳅精子的存活时间仅1-2min，活动力和受精率均很低。Yasui等(2009)研究了泥鳅精子冷冻保存的稀释液、精子内部冷冻保护剂和外部保护剂、以及冷冻保存方法，但复苏后，精子的受精率只有47％，远低于鲜精的受精率。

针对目前泥鳅精子超低温冷冻保存中存在的复苏率低、复苏后受精力差等问题，申请人对泥鳅精子冷冻保存的相关因子进行了系统的研究，经过反复试验，筛选出了一种适合于泥鳅精子的超低温冷冻保存液及冷冻复苏方法。利用该方法对泥鳅的精子进行冷冻保存，复苏后的精子活率高达72.3％。用复苏后的精子对泥鳅卵受精，获得了近似鲜精的受精率(81.5％)。本方法冻存量大、效果好、简便易行、无需昂贵的仪器设备，能解决实际生产中泥鳅雄性个体少、精卵适时受精等问题，为泥鳅苗种的规模化生产和遗传育种研究提供便利。

发明内容

本发明的目的在于提供一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液，该保存液配制方法简单、便于存贮。

本发明的另一个目的在于提供一种泥鳅精子的冷冻复苏方法，利用该方法对泥鳅的精子进行超低温冷冻保存，复苏后的精子活率达72.3％。用复苏后的精子对泥鳅卵受精，受精率达81.5％，孵化率达84.9％，与鲜精没有显著性差异(P＞0.05)。本方法能解决实际生产中泥鳅雄性个体少、精卵适时受精等问题，为泥鳅苗种的规模化生产和遗传育种研究提供便利。

本发明的最后一个目的在于提供了一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液的应用。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液，包括：