[发明专利]一种检测新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种检测新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用。所述荧光定量PCR试剂盒中含有SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示的引物和SEQ ID NO.3所示的探针，以及标准品和荧光定量PCR反应试剂。本发明的荧光定量PCR试剂盒可以对该新型鸭呼肠孤病毒进行检测，该试剂盒的特异性强，只与新型鸭呼肠孤病毒特异性结合，与其他鸭源病毒都没有交叉反应；而且检测的灵敏度高，在标准品为4×10¹‑4×10⁹拷贝范围内都有极好的线性关系，检测范围可达9个数量级，可以高效检测新型鸭呼肠孤病毒病鸭组织以及无临床症状的病毒携带鸭，提高了检测效率。

技术领域

本发明涉及禽病毒检测技术领域，具体涉及一种检测新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用。

背景技术

禽呼肠孤病毒属于呼肠孤病科(Reovirdae)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)，可以引起禽类发生多种疾病，其临床表现因病毒毒株、毒力或感染宿主的不同而有差异。

2016年起，我国山东、河北、河南及江苏等地鸭大范围爆发以跗关节肿大为主要症状的传染性疾病，该病主要引起各个年龄阶段鸭跗关节肿胀，跗关节常含有少量黄色或血样渗出物，严重病例，关节腔中有干酪样渗出物，患鸭出现不同程度的跛行。该病主要导致种鸭产蛋和肉鸭体重的下降，料肉比升高，肉鸭出栏合格率显著降低，对肉鸭以及种鸭养殖业造成严重经济损失。

经研究发现，该病的爆发是由一种新型的鸭呼肠孤病毒感染所致，目前尚无疫苗可以进行预防，现有市售的鸭呼肠孤病毒疫苗无法对该病进行有效的防控；常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效。在当前这种情况下，控制该病的有效措施是对该新型鸭呼肠孤病毒感染进行监测，以便及早发现感染鸭群对其采取隔离或扑杀措施，以减少新型鸭呼肠孤病毒感染所带来的损失。

目前，对于禽呼肠孤病毒的检测方法主要包括细胞学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断三大类，其中，细胞学诊断技术主要是利用细胞分离培养和电镜观察。该方法操作较为繁琐，检测周期长，检测条件要求较高。免疫学诊断技术主要包括酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫荧光方法，该类方法灵敏较高，但对抗体要求也高。分子生物学诊断技术主要包括传统聚合酶链式反应(PCR)方法以及荧光PCR方法，而传统PCR方法只能对病毒感染定性，不能定量，灵敏度也较低；荧光定量PCR技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛的应用。目前已有采用荧光定量PCR方法检测牛群中呼肠孤病毒的报道，但由于该新型鸭呼肠孤病毒系首次报道，针对哺乳动物和其他禽类的呼肠孤病毒诊断策略不能用于该新型鸭呼肠孤病毒的检测，迄今仍未有检测该新型鸭呼肠孤病毒的有效方法。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一组引物和探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。具体如下：

正向引物：M1-F：ATTATCCATTTTGAGATCCACG；(SEQ ID NO.1)

反向引物：M1-R：TTGGTTGCTTTCCTAGCGCTT；(SEQ ID NO.2)

荧光探针：5’-FAM-TGCGAGTCGGTTCTAGTCGCA-TMARA-3’；(SEQ ID NO.3)

本发明的第二方面，提供上述引物和探针在制备检测新型鸭呼肠孤病毒的试剂或试剂盒中的应用。

所述新型鸭呼肠孤病毒已于2018年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201818，地址：中国武汉，武汉大学。