[发明专利]视网膜节细胞的制备方法

说明书

本发明提供一种视网膜节细胞的制备方法，包括如下步骤：获取体细胞；构建慢病毒颗粒，用所述慢病毒颗粒转染所述体细胞，从而将Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到体细胞染色体上；诱导培养，获得视网膜节细胞。所得到的视网膜节细胞，通过将外源Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到小鼠成纤维细胞染色体上过表达制备获得。与现有技术相比，本发明创造性地挑选Ascl1基因、Brn3b基因和Islet1基因的组合，通过慢病毒介导的方式使这三个转录因子在体细胞中过表达，能够在诱导培养7天的情况下，实现超过10％的体细胞转分化为Brn3a阳性、Tuj1阳性的视网膜神经节样细胞，效率高。

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别是涉及一种视网膜节细胞的制备方法。

背景技术

自诺贝尔奖得主山中伸弥发现通过过表达Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc四个转录因子可以将体细胞重编程为多能干细胞(iPS)以来，人们陆续发现通过过表达组织特异性转录因子可以将体细胞直接重编程为其它谱系的体细胞，而无需经过多能干细胞阶段(体细胞直接重编程)。2010年，美国的Marius Wernig实验室发现同时过表达Ascl1，Brn2和Myt1l，可以将小鼠成纤维细胞高效地直接重编程为Tuj1阳性的神经元(Nature 2010，463：1035-41)。这一发现为再生治疗神经退行性疾病开辟了崭新，方便而快捷的供体细胞制备途径。但是这一方法得到的神经元仅仅是普通的泛神经元，而治疗各种神经退行性疾病需要针对此疾病的特定神经元亚型。为此，人们通过筛查不同的因子组合实现了体细胞直接重编程制备多巴胺神经元，运动神经元等神经元亚型的有效方法。但是当前尚缺乏体细胞直接重编程制备视网膜神经元的有效方法。

在发病率最广泛的视网膜退行性疾病-青光眼中视网膜节细胞受到损害而永久丢失，导致视力不可逆丧失。视网膜节细胞移植治疗有望解决青光眼不治之难题。因此建立体细胞直接重编程制备视网膜节细胞的方法具有巨大的临床应用价值，但当前在此领域进展有限。虽然有报道，过表达Ascl1，Brn3b和Ngn2可以将小鼠成纤维细胞重编程为Brn3a阳性的视网膜节细胞样细胞(Neuroscience 2013,250:381-93)，但是此报道中的方法获得视网膜节细胞样神经元的效率不够高。

因此，亟待探索一种效率高的体细胞直接重编程制备视网膜节细胞的方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种视网膜节细胞的制备方法，该制备方法能够高效的将体细胞直接重编程为视网膜节细胞。

本发明的技术方案是通过以下技术方案实现的：

一种视网膜节细胞，通过将外源Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到小鼠成纤维细胞染色体上过表达制备获得。

一种视网膜节细胞的制备方法，包括如下步骤：

获取体细胞；

构建慢病毒颗粒，用所述慢病毒颗粒转染所述体细胞，从而将Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到体细胞染色体上；

诱导培养，获得视网膜节细胞。

在其中一些实施例中，所述的体细胞为小鼠成纤维细胞。

在其中一些实施例中，所述慢病毒颗粒的构建包括如下步骤：

(1)获取Ascl1基因的全长cDNA、Islet1基因的全长cDNA、Brn3b基因的全长cDNA；

(2)将所述Ascl1基因的全长cDNA、Islet1基因的全长cDNA、Brn3b基因的全长cDNA克隆到同一慢病毒载体上，获得慢病毒表达质粒；

(3)用慢病毒表达质粒、诱导因子表达质粒、包装质粒转染包装细胞，然后于包装细胞的上清液中收集慢病毒颗粒。