[发明专利]视网膜节细胞的制备方法

权利要求书

1.一种视网膜节细胞，其特征在于，通过将外源Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到小鼠成纤维细胞染色体上过表达制备获得。

2.一种视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取体细胞；

构建慢病毒颗粒，用所述慢病毒颗粒转染所述体细胞，从而将Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到体细胞染色体上；

诱导培养，获得视网膜节细胞。

3.根据权利要求2所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述的体细胞为小鼠成纤维细胞。

4.根据权利要求2或3所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒颗粒的构建包括如下步骤：

(1)获取Ascl1基因的全长cDNA、Islet1基因的全长cDNA、Brn3b基因的全长cDNA；

(2)将所述Ascl1基因的全长cDNA、Islet1基因的全长cDNA、Brn3b基因的全长cDNA克隆到同一慢病毒载体上，获得慢病毒表达质粒；

(3)用慢病毒表达质粒、诱导因子表达质粒、包装质粒转染包装细胞，然后于包装细胞的上清液中收集慢病毒颗粒。

5.根据权利要求4所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，获取所述Brn3b基因的全长cDNA的步骤包括：

提取小鼠胚胎头部组织总RNA，用反转录酶反转录为cDNA库；以所述cDNA库为模板，以SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为引物，进行PCR扩增；或/和，

获取Islet1基因的全长cDNA的步骤包括：

提取小鼠胚胎头部组织总RNA，用反转录酶反转录为cDNA库；以所述cDNA库为模板，以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物，进行PCR扩增；或/和，

获取所述Ascl1基因的全长cDNA的步骤包括：

以TetO-FUW-Ascl1为模板，以SEQ ID No.5、SEQ ID No.6为引物，进行PCR扩增。

6.根据权利要求5所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述Brn3b基因的全长cDNA如SEQ ID No.9所示；所述Islet1基因的全长cDNA如SEQ ID No.8所示；所述Ascl1基因的全长cDNA如SEQ ID No.7所示。

7.根据权利要求4所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述的慢病毒载体为pSicoR-TetO；所述诱导因子表达质粒为诱导因子rtTA表达质粒；所述包装细胞为HEK293细胞；所述包装质粒为psPAX2、pMD2.G。

8.根据权利要求2至7任一项所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述诱导培养包括：培养所述转染后的体细胞至视网膜节细胞的状态时，采用添加有毛喉素的诱导培养基进行诱导培养。

9.根据权利要求11所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述毛喉素的在所述诱导培养基中的终浓度为4.2～8.4μg/ml。

10.用于制备视网膜节细胞的融合质粒，其特征在于，该融合质粒中包含有Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因。