[发明专利]一种用于凝血酶活性检测的质谱探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于凝血酶活性检测的质谱探针及其制备方法和应用，属于药物筛选和评价领域。所述的质谱探针，包括氨基酸序列为Phe‑Pro‑Arg‑β‑Ala的多肽及修饰在所述多肽的β‑丙氨酸上的哌嗪类化合物。本发明提供的质谱探针由可被凝血酶特异性识别的多肽Phe‑Pro‑Arg‑β‑Ala与高质谱响应的小分子哌嗪类化合物连接而成，不仅能被凝血酶特异性识别并酶切，同时具有极高的质谱响应，质谱检测准确度高，能够准确反应凝血酶的活性或凝血酶抑制剂的抑制活性，也非常适用于从中药等复杂体系中筛选具有凝血酶抑制活性的化合物。

技术领域

本发明涉及药物筛选和评价领域，具体涉及一种用于凝血酶活性检测的质谱探针及其制备方法和应用。

背景技术

凝血酶(thrombin)属于丝氨酸蛋白酶家族，在机体凝血系统中扮演着重要角色，参与凝血过程中的多个关键环节。凝血酶可促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变为不溶的纤维蛋白，同时激活多个凝血因子，形成血栓。血栓与许多心血管疾病密切相关，如动脉粥样硬化、心肌梗死和冠心病等。因此，凝血酶是治疗心血管疾病的重要靶点之一，直接凝血酶抑制剂(direct thrombin inhibitor)由于无需辅助因子即可抑制凝血酶，受到了药物研发人员的极大重视。

目前使用较为广泛的直接凝血酶抑制剂包括以水蛭素为代表的二价抑制剂(主要为多肽类药物)，以及以阿加曲班为代表的一价抑制剂(主要为小分子药物)。此外，从天然产物和传统中药中发现具有凝血酶抑制活性的化合物也是近年来药物筛选领域的一个研究热点。

凝血酶抑制剂的筛选离不开相应的酶活性检测方法。目前，凝血酶活性的检测方法主要包括凝血酶滴定法、抗凝法和发色底物法。

凝血酶滴定法的原理为水蛭素可与凝血酶等比结合形成不可逆的复合物，因此在凝固终点通过水蛭素用量即可计算凝血酶活性。该方法经济简单，易于使用，但重复性和准确度较低且易受干扰，很难用于复杂体系中的药物筛选。

抗凝法通过血凝仪测定凝血酶原时间、凝血酶时间和促凝血酶原激酶时间等，需要实验动物，流程较繁琐。

发色底物法采用光学检测方法测定凝血酶/底物反应前后的吸光度，专属性较高，适用于体内和体外检测，但是，发色底物法通常采用分光光度法测定，灵敏度较低，且易受本底的干扰，难以测定在底物吸收波段有较强吸收的样品，极大地限制了该方法在天然产物筛选中的应用。

在蛋白质组学研究中，为了提高蛋白质谱离子化的效率，常使用化学衍生试剂在肽段上修饰特殊的化学基团。如通过在肽段的氨基、羧基或巯基上引入易于离子化的小分子标签，肽段化学衍生技术可以显著提高肽段的灵敏度和专属性，同时拓展质谱的检测范围。该技术为设计高质谱灵敏度的酶底物提供了一种新思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种的高质谱响应的质谱探针，作为酶底物，被凝血酶特异性识别，通过质谱测定酶切反应前后的探针或酶切产物的量来检测凝血酶的活性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于凝血酶活性检测的质谱探针，包括氨基酸序列为Phe-Pro-Arg-β-Ala的多肽及修饰在所述多肽的β-丙氨酸上的哌嗪类化合物。

本发明的质谱探针由可被凝血酶特异性识别的多肽与高质谱响应的小分子连接而成。所述多肽的氨基酸序列为：苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-β-丙氨酸(SEQ ID NO.1)，所述的高质谱响应的小分子为哌嗪类化合物，哌嗪类化合物的-NH与多肽链上的β-丙氨酸的羧基缩合。

凝血酶酶切位点为精氨酸与β-丙氨酸之间的酰胺键，因此，本发明质谱探针的酶切产物为苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸和β-丙氨酸-哌嗪类化合物。由于哌嗪类化合物具有很强的质谱响应，因此通过测定反应前后该探针或酶切产物β-丙氨酸-哌嗪类化合物的量，即可检测凝血酶的活性。