[发明专利]SCA3基因CAG重复序列动态突变的引物及检测方法

权利要求书

1.一种SCA3基因CAG重复序列动态突变的引物，其特征在于，famF向引物5’端带5’-FAM荧光基团，反向引物3’端包含5个CTG重复，引物序列如下：

SCA3-famF：CCAGTGACTACTTTGATTCGTGAAACAATG；

SCA3-R：TCCTGATAGGTCCCCCTGCTGCTGCTGCTG。

2.一种如权利要求1所述引物的检测方法，其特征在于，采用如下步骤：

(1)、对提取的DNA进行PCR扩增；

(2)、对PCR扩增产物进行毛细管电泳；

(3)、数据分析；

——所述的PCR扩增采用如下步骤：

2.1、试剂配置：按DNA检测样本数量配置扩增反应液混合液，每份19ul分装，所述扩增反应液混合液中：2×PreMix ExTaq试剂用量10×n μl；浓度为10uM的SCA3-famF引物用量1×n μl；浓度为10uM的SCA3-R引物用量1×n μl；ddH₂O用量7×n μl；所述n＝检测样本数+1；

2.2、加样：在19ul扩增反应混合液中加入1ul DNA；

2.3、扩增：在PCR仪中先以95℃变性5分钟；再运行35次如下循环：95℃变性1分钟、65℃退火1分钟、72℃延伸2分钟；之后72℃延伸15分钟，4℃保存，完成PCR扩增程序；

——所述对PCR扩增产物进行毛细管电泳采用如下步骤：

3.1、样本稀释：对PCR扩增产物进行20倍和100倍样本稀释，分别在19ul的ddH₂O和99ul的ddH₂O中加入1ulPCR扩增产物；

3.2、配置上机混合液：取ABI GS500-LIZ内标和HIDI按1∶99的体积比混合后，取9ul混合液与与上述稀释后的PCR扩增产物1ul混合制成上机混合液；

3.3、预变性：将配置好的上机混合液在PCR仪上以95℃运行3分钟后，冰水混合物中极速冷却5分钟，作变性处理；

3.4、毛细管电泳：上机混合液在ABI3730xl测序仪中进行检测，采用G5颜色分组，在ABI3730xl测序仪中的分型参数设置如下：检测恒温OVEN_Temperature 60℃，缓冲液温度Buffer_Temperature 35℃；预电泳电压PreRun_Voltage 15kV，预电泳时间PreRunTime180s；注入电压Injection_Voltage为1.5kV；注入时间Injection_Time为15s；第一次读数First_ReadOut_Time 300ms；第二次读数Second_ReadOut_Time 300ms；电泳电压Run_Voltage 15kV；突跳步数Voltage_Number_of_steps设置为10步；突跳电压Voltage_steps_Interval设置为20s；电压容差Voltage_Tolerance设置为0.6kV；电流Current_Stability为30uA，变温延迟Ramp_Delay ls；日期延迟Data_Delay 600s；电泳时间Run_Time 1600s。

3.如权利要求2所述引物的检测方法，其特征在于，所述数据分析为采用genemapper4.0软件中对分型结果进行判读，分析方法采用该软件默认设置，核对校正内标峰后定义164bp处为(CAG)₅处，根据每隔3bp左右出现的荧光串峰个数判断CAG重复数，(CAG)₅之后第一个最高峰所对应的CAG重复数为第一个等位基因，之后如果还有荧光串峰，则选取五指峰中的最高峰所对应的CAG重复数作为第二个等位基因。