[发明专利]一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的检测及质控方法

权利要求书

1.一种胎儿染色体非整倍体检测中DNA的检测及质控方法，其特征在于，包括：

步骤A：样本采集、保存及质控；

步骤B：DNA提取；

步骤C：文库构建；

步骤D：文库浓度测定及保存；

步骤E：上机测序；

步骤F：结果分析；

其中，所述步骤A包括：

样本采集：采血管一采集5.0mL孕妇外周血，采集完毕后，轻柔颠倒采血管并及时将采血管放置冰箱中；采血管二采集10.0mL孕妇外周血，采集完毕后，轻柔颠倒采血管并常温保存；预冷低速离心机至温度稳定后，放入采血管二，离心分钟，吸取上清血浆，转移至置于冰盒上的2.0mLEP管中，标记相应的样品编号；预冷高速离心机至温度稳定后，放入上步所得2.0mLEP管并离心，枪头对着非白细胞沉淀处，在冰盒上吸取上清血浆，分装至置于冰盒上的1.5mLEP管中，每管转入400uL血浆，标记样品编号和血浆管数，立即放入冰箱中保存；对该保存的样品进行质控和处理。

2.根据权利要求1所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的检测及质控方法，其特征在于，所述步骤C包括：

步骤a：对样本DNA进行物理打断，得到片段化DNA溶液；

步骤b：对所述片段化DNA进行末端修复及磁珠纯化，得到纯化好的平末端DNA；

步骤c：对所述平末端DNA进行接头连接，得到连接接头的DNA；

步骤d：对所述连接接头的DNA进行PCR扩增，得到文库；

其中，所述步骤c具体包括：

在离心管中依次加入平末端DNA、无核酸酶水、连接缓冲液、dNTP、DNA连接酶、P1接头和标签序列X并混匀，反应后加入磁珠吹打混匀，静置5分钟；

将离心管放置在磁力架上，待磁珠吸附完全溶液变澄清之后吸去上清；加入75％乙醇，转动离心管，溶液澄清后吸去上清；

取下离心管，离心数秒后将离心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全之后吸去残留溶液，敞开管盖，室温晾干；

加入TE溶液，吹打混匀后静置；瞬时离心后将离心管置于磁力架上静置至溶液澄清，将管内液体转移至PCR管，得到连接接头的DNA。

3.根据权利要求2所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的检测及质控方法，其特征在于，所述步骤D包括：

步骤D1：稀释待测样品，准备标准品，并将两者都低温保存；

步骤D2：取离心管，在管盖上做好标记，按照下表中的反应体系配制反应混合液，配制时按照每个样品做2次重复反应所需的量配制体系，反应混合液包括定量扩增试剂、无核酸酸酶水、P1引物和P2引物，配制完成后，将反应混合液振荡，瞬时离心至管底；

步骤D3：将所述步骤D2中配好的反应混和液加到反应板的各反应管孔中，向标准品反应孔中分别加入2L的标准品，每个反应板同时设置无模板对照反应孔，孔中加入2uL无核酸酶水；

步骤D4：使用封膜工具和光学粘性膜密封所述反应板，使用离心机离心反应板，将反应板装载到荧光定量PCR扩增仪并进行设置后开始运行qPCR反应，得到文库浓度测定结果。

4.根据权利要求3所述的胎儿染色体非整倍体检测中DNA的检测及质控方法，其特征在于，所述步骤D4中设置程序具体包括：

步骤1：在Plate Setup界面，选好标准品孔和样本孔，重复系数均为2；

步骤2：在荧光定量PCR扩增仪上设置程序：先95℃1分钟；后95℃15秒，65℃15秒，72℃30秒循环30次；再后95℃15秒，65℃1分钟，95℃15秒；

步骤3：在Melting Curve Stage阶段中设置“65℃1分钟，95℃15秒”，65℃到95℃的升温过程中设置收集熔解曲线，如有收集熔解曲线方式选项，则选择Step and hold方式；

步骤4：设置反应体系为20uL，单击RUN开始进行qPCR反应。