[发明专利]胰腺癌基底微绒毛的检测方法和应用

权利要求书

1.一种测量胰腺癌基底微绒毛物理参数的方法，其特征在于，具体步骤包括：病理切片3D免疫荧光染色，微血管基底微绒毛长度和密度的检测、计数；其中：

（一）病理切片3D免疫荧光染色，具体流程为：

病理切片：对肿瘤组织用4%多聚甲醛固定24-48小时，再用10%-30%蔗糖依次脱水至组织下沉；然后利用冰冻切片机制作40-50微米切片，放入含有PBS溶液的6孔板中保存；

免疫荧光染色，具体步骤为：

（1）将组织切片挑入孔板中用PBS清洗3-6次，每次10-30分钟；再挑入封闭液中室温封闭50-90分钟；封闭液成分为：10% 驴血清 、0.01%-0.2% Triton X-100和PBS；

（2）挑入含I抗的孵育液中，在4℃摇床上孵育过夜；孵育液成分为5%驴血清、0.01%-0.2% triton X-100和PBS；

（3）将组织切片在PBS溶液中洗3-6次，每次10-30分钟；然后挑入含相应的荧光II抗和DAPI孵育液中，摇床上室温孵育1.5-2.5个小时或4℃过夜；

（4）II抗缓冲液孵育完成后再用PBS清洗3-6次，每次10-30分钟；

（5）清洗完以后，将组织切片移到载玻片上展片，用水溶性封片剂封片；

（6）室温闭光过夜，然后进行扫描、记数；

（二）微血管基底微绒毛长度和密度的检测、计数；

（1）采用3D扫描；

（2）通过Image J软件把Z-轴扫描图片Z-stacked， 然后测量微血管的表面面积，计算微绒毛数量并测量微绒毛长度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用3D扫描的具体流程为：

1）在Zeiss 710 63倍油镜下寻找组织内基底微绒毛最多的微血管；

2）Z-轴确定微血管的厚度；

3）激光共聚焦显微镜下Z-stack扫描；Zeiss 710激光共聚焦显微镜扫描参数为：

像素：1024*1024 （pixel），线性:2；

Z-stack 间距: 1μm；

扫描速度: 5；

Digital offset: 100-250；

组织之间会有一定的染色背景差异，因此其它参数可以根据需求进行调整。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述计算微绒毛数量是利用软件中的细胞计数菜单计数功能进行计数，具体流程如下：

1）首先初始化图片，进入计数界面；

2）选择计数类型按钮；

3）利用鼠标右键计数血管表面微绒毛；

4）计数后把数据存入到excel数据表。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测量微绒毛长度的流程为：

1）使用分段线勾画出为微绒毛轮廓，然后利用测量按钮测量其长度；

2）保存数据。

5.由根据权利要求1-4所述方法得到的胰腺癌基底微绒毛物理参数，在预测胰腺癌肿瘤组织糖摄取能力中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，微血管基底微绒毛长度的均值和中位数均与肿瘤组织的糖摄取能力直接相关，p<0.001，相关系数分别是0.799 和0.805；微血管基底微绒毛密度的均值和中位数也与肿瘤组织糖摄取能力直接相关，p<0.001，相关系数分别（r）是0.767 和0.813；微血管基底微绒毛密度和长度的均值和中位数的联合参数与肿瘤组织糖摄取能力相关性更强，相关系数分别（r）为0.883 和0.894 。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将肿瘤组织的糖摄取能力分为四个等级：1级，弱：PET SUVmax 值2.5-5.6； 2级，中等：PET SUVmax 值5.7-7.5；3级，强：PET SUVmax值7.6-8.8；4级，超强：PET SUVmax 值>8.9；

据此，用基底微绒毛的各种参数预测肿瘤代谢的方式如下：

（1）微绒毛密度平均值为4.85（95%CI 2.79-7.104）为糖摄取能力弱；微绒毛密度平均值为6.85（95%CI 3.94-9.48）为糖摄取能力中等； 微绒毛密度平均值是8.13（95%CI 5.94-10.69）为糖摄取能力强；微绒毛密度平均值是8.38（95%CI 5.43-10.97）为糖摄取能力超强；

（2）微绒毛密度中位数值是4.52 （95%CI 2.35-6.36） 为糖摄取能力弱；微绒毛密度中位数值是6.30（95%CI 3.58-8.60）为糖摄取能力中等；微绒毛密度中位数是7.78（95%CI5.61-10.27）为糖摄取能力强；；微绒毛密度中位数是8.02 （95%CI 5.33-10.38）为糖摄取能力超强；

（3）微绒毛长度平均值是9.58 （95%CI 6.81-12.33）为糖摄取能力弱；微绒毛长度平均值是11.80 （95%CI 10.26-13.90）为糖摄取能力中等；微绒毛长度平均值13.50 （95%CI12.90-14.36）为糖摄取能力强；微绒毛长度平均值是15.47 （95%CI 12.158-27.20）为糖摄取能力超强；

（4）微绒毛长度中位数是8.94 （95%CI 6.51-11.40） 为糖摄取能力弱；微绒毛长度中位数是11.28 （95%CI 9.59-13.80） 为糖摄取能力中等；微绒毛长度中位数是12.95 （95%CI 12.27-13.99）为糖摄取能力强；微绒毛长度中位数是14.14 （95%CI 11.32-18.31）为糖摄取能力超强；

（5）微绒毛密度和长度平均值参数是1.47（95%CI 0.70-2.21） 为糖摄取能力弱；微绒毛密度和长度平均值参数是2.54 （95%CI 1.50-3.83） 为糖摄取能力中等；微绒毛密度和长度平均值参数是3.42 （95%CI 2.68-4.34）为糖摄取能力强；微绒毛密度和长度平均值参数是4.06 （95%CI 2.24-6.07）为糖摄取能力超强；

（6）微绒毛密度和长度中位数参数是1.28（95%CI 0.59-1.81） 为糖摄取能力弱；微绒毛密度和长度中位数参数是2.23 （95%CI 1.32-3.52）为糖摄取能力中等；微绒毛密度和长度中位数参数是3.14（95%CI 2.45-4.07）为糖摄取能力强；微绒毛密度和长度中位数参数是3.59 （95%CI 2.07-5.27）为糖摄取能力超强。