[发明专利]玉米大斑病菌LAMP检测引物及其快速检测方法和应用

说明书

本发明提供了一种玉米大斑病菌LAMP检测引物及其快速检测方法和应用，专用于玉米大斑病菌的特异性检测，属于农作物病害检测和生物技术领域，设计了一种玉米大斑病菌LAMP检测引物，包括外引物F3和B3，以及内引物FIP和BIP，见序列表。基于该引物建立的玉米大斑病菌检测方法，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。所发明的LAMP检测引物及其检测方法能在生产实践中实现感染玉米大斑病菌植株的快速、灵敏、准确检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为玉米大斑病的早期预警和防控提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明涉及一种玉米大斑病菌LAMP检测引物及其快速检测方法和应用，专用于玉米大斑病菌的快速分子检测，同时可实现田间玉米大斑病的早期诊断和病菌的监测、鉴定，属于农作物病害检测、鉴定、防治及生物技术领域。

背景技术

玉米以其用途广、产量高、对种植条件要求低等优点在世界上多个国家广泛种植。在我国，玉米是种植面积居首位、产量居次席的重要粮食和经济作物，除作为粮食用途外，现代玉米产业还发展出能源、饲料、果蔬等多种用途。玉米产业健康发展对改善我国农业产业结构，保障粮食安全，扩大国民经济总量具有十分积极的重要作用。

玉米大斑病(northern corn leaf blight，NCLB)是由凸脐蠕孢菌(Exserohilumturcicum)侵染引起的严重叶枯性真菌病害，可以为害叶片，严重时也为害叶鞘和苞叶。1876年玉米大斑病在意大利首次报道，20世纪初期已经广泛发生于美洲、欧洲、亚洲和大洋洲的玉米产区，成为当今世界上玉米主要叶部病害之一，有时还会引起玉米根腐病、茎腐病的其他玉米病害的发生为害。据报道，玉米大斑病一般年份减产20％左右，严重时减产50％以上。玉米大斑病菌病原以菌丝体及分生孢子随病残体越冬，成为第2年发病的初侵染来源，在玉米生长季节越冬菌源产生分生孢子，随雨水或气流传播至健康玉米叶片上，在适宜的温湿度条件下萌发侵入。如在感病品种上，侵入14天左右即可引起局部萎蔫，组织坏死，进而形成枯死病斑，病斑上又可以产生大量分生孢子，随气流传播造成多次侵染，造成病害爆发流行。因此玉米大斑病菌的侵染初期至病害的初发期是病害防治的最佳时期，而大斑病菌侵染初期难以从症状上与灰斑病、圆斑病及小斑病区分，且以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差，难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行。而玉米大斑病菌在形态特征上与玉米小斑病菌即玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolarismaydis)极其相似，难以鉴定，因此迫切需要建立一种快速、灵敏的检测方法用于玉米大斑病的早期诊断，为病害的最佳防治时期提供技术支撑。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是由日本科学家Notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30min-60min内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比传统的PCR技术，LAMP技术全程恒温反应，无需PCR仪，且扩增量大灵敏度高。

发明内容

针对现有技术中对玉米大斑病菌的检测和鉴定程序繁琐、耗时长、对鉴定经验要求高、准确度低，PCR检测需要依靠扩增仪等设备的问题，本发明提供了一种玉米大斑病菌LAMP检测引物及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种玉米大斑病菌LAMP检测引物，所述玉米大斑病菌LAMP检测引物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP，各引物的核苷酸序列为：

F3:5’-GGAAGGGCACCATGTTGAC-3’；