[发明专利]玉米大斑病菌LAMP检测引物及其快速检测方法和应用在审
| 申请号： | 201810482897.4 | 申请日： | 2018-05-18 |
| 公开（公告）号： | CN108546772A | 公开（公告）日： | 2018-09-18 |
| 发明（设计）人： | 杜宜新;石妞妞;阮宏椿;陈福如;甘林;杨秀娟;代玉立 | 申请（专利权）人： | 福建省农业科学院植物保护研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/45 |
| 代理公司： | 北京中济纬天专利代理有限公司 11429 | 代理人： | 张磊 |
| 地址： | 350013 福*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 玉米大斑病菌 引物 快速检测 检测 琼脂糖凝胶电泳检测 生物技术领域 农作物病害 特异性检测 玉米大斑病 内引物FIP 恒温扩增 绿色荧光 生产实践 田间病害 显色反应 早期预警 早期诊断 准确检测 植株 可观察 特征性 外引物 可用 条带 病菌 灵敏 应用 感染 监测 | ||
1.一种玉米大斑病菌LAMP检测引物，其特征在于：所述玉米大斑病菌LAMP检测引物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP，各引物的核苷酸序列为：
F3:5’-GGAAGGGCACCATGTTGAC-3’；
B3:5’-GCTGGTGGAGAACTCTGAC-3’；
FIP:5’-ACCTCGTCTCCGCCGTCATGT-AGAGTTAAGCTGACCAGGGA-3’；
BIP:5’-GGTTCAGGTCGCCGTACGAG-CTGCATTGACAACGAGGCT-3’。
2.一种玉米大斑病菌LAMP快速检测方法，其特征在于：利用正向外引物F3：5’-GGAAGGGCACCATGTTGAC-3’、反向外引物B3：5’-GCTGGTGGAGAACTCTGAC-3’、正向内引物FIP：5’-ACCTCGTCTCCGCCGTCATGT-AGAGTTAAGCTGACCAGGGA-3’以及反向内引物BIP：5’-GGTTCAGGTCGCCGTACGAG-CTGCATTGACAACGAGGCT-3’建立LAMP检测方法，对玉米大斑病菌进行检测。
3.根据权利要求2所述的玉米大斑病菌LAMP快速检测方法，其特征在于：LAMP反应体系为25μL，反应体系包括0.2mmol/L F3，0.2mmol/L B3，1.6mmol/L FIP，1.6mmol/L BIP，BstDNA聚合酶为8U，DNA模板50～100ng，12.5μL的LAMP反应混合液，用无菌的超纯水补足25μL，其中，DNA模板从待检测玉米样品中提取。
4.根据权利要求3所述的玉米大斑病菌LAMP快速检测方法，其特征在于：LAMP反应混合液含40mM Tris-HCl,20mM(NH4)2SO4,20mM KCl,16mM MgSO4,1.6mol/L甜菜碱,2.0mMdNTPs,0.2％Trion X-100。
5.根据权利要求4所述的玉米大斑病菌LAMP快速检测方法，其特征在于：LAMP反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
6.根据权利要求2所述的玉米大斑病菌LAMP快速检测方法，其特征在于：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR green I 1.0μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色或橘黄色判断为阴性。
7.根据权利要求2所述的玉米大斑病菌LAMP快速检测方法，其特征在于：待LAMP反应结束后，取2.0μL LAMP扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带判断为阳性，没有出现梯形条带则判断为阴性。
8.一种权利要求1中所述的LAMP检测引物的应用，其特征在于：LAMP检测引物应用于玉米大斑病的早期诊断和病菌鉴定。
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