[发明专利]一种海洋酵母菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法

权利要求书

1.一种海洋酵母菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法,其特征在于包括如下步骤：

（1）首先取得海洋酵母菌菌种；

（2）将海洋酵母菌菌种进行发酵得生物表面活性剂发酵液；

（3）将无柄小叶榕种植于污染土壤中，再将生物表面活性剂发酵液添加至污染土壤中，与无柄小叶榕联合修复污染土壤；

所述海洋酵母菌为海洋解脂耶罗维亚酵母菌；

所述步骤（2）的发酵温度为28℃，摇床培养条件为150 rpm•min^-1、72小时后得生物表面活性剂发酵液；

步骤（3）为首先将生物表面活性剂定量：将步骤（2）中的发酵液依次经过酸沉淀法粗提、减压蒸馏纯提取、最后经真空冷冻干燥提取得纯的生物表面活性剂粉末，将粉末称量计算生物表面活性剂的产率；以干土质量计，生物表面活性剂纯品在土壤中的添加浓度为10mg•kg^-1—1000mg•kg^-1，通过生物表面活性剂的产率计算生物表面活性剂发酵液在土壤中的添加量进行添加，发酵液添加方式为一次性添加或者分多次添加；

所述步骤（3）中还添加有化学螯合剂柠檬酸或者乙二胺四乙酸，两者在土壤中的添加量均为 0.1mmol•kg^-1-10mmol•kg^-1。

2.如权利要求1所述的一种海洋酵母菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法，其特征是生物表面活性剂在土壤中的添加浓度为100mg•kg^-1—300mg•kg^-1。

3.如权利要求1或2所述的一种海洋酵母菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法，其特征是所述步骤（3）中柠檬酸或者乙二胺四乙酸在土壤中的添加量均为1 mmol•kg^-1。

4.如权利要求1或2所述的一种海洋酵母菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法，其特征是所述步骤（1）包括如下步骤：

(a)将采集的海水和底泥浓缩液进行富集培养并进行筛选；

(b)通过生理生化以及分子生物学方法对筛选得到的菌株进行鉴定。

5.如权利要求4所述的一种海洋酵母菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法，其特征是所述步骤（1）的详细步骤如下：

(a) 将采来的海水样品和经无菌水处理的底泥浓缩液在灭菌的人工海水培养基中，28℃，200r/min条件下进行富集培养；对制造生物表面活性剂的菌株通过如下几种方法进行筛选：①柴油降解率测定，②液滴坍塌实验，③免疫溶血实验，④排油圈大小的测定，⑤表面张力测定；

（b）菌种鉴定：

对筛选得到的产生物表面活性剂菌株进行分子生物学鉴定，18S rRNA序列分析；菌株经DifcoTM Matine Agra 2216 28℃，24h纯化培养，利用Axygen基因组DNA提取试剂盒提取DNA，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测酵母菌DNA质量，在TE Buffer管中将DNA稀释至70ng/μL用作PCR扩增模板，利用正向引物5'-3' ATCTGGTTGATCCTGCCAGT和反向引物5'-3'GATCTTCCGCAGGTTCACC 进行扩增，扩增体系：模板DNA0.5μL，10×Buffer5μL，25mM MgCl₂ 4μL，dNTP1μL，正向及反向引物1μL，Taq DNA聚合酶0.25μL；通过NCBI网站对比，找出与目的基因同源性最高的已知菌种，从GenBank数据库中找出近源菌株的18S rRNA序列，与测定序列共同进行Clustal X程序校准多序列比较；进一步地，通过革兰氏染色、甲基红实验、乙酰甲基醇实验、糖发酵实验、柠檬酸实验、明胶液化实验、吲哚试验、硫化氢实验进行生理生化鉴定。