[发明专利]一种巢式PCR检测试剂盒及其在黄栌枯萎病菌检测中的应用

说明书

本发明提供了一种巢式PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：用于第一轮PCR扩增的引物P1和引物P2；和用于第二轮PCR扩增的引物PN1和引物PN2；所述引物P1、P2、PN1和PN2在PCR扩增反应中分别具有与SEQ ID NO.1至4相同或相似的扩增功能。本发明还提供所述试剂盒在检测黄栌枯萎病菌(Verticillium dahliae)中的应用。本发明还提供了一种利用所述试剂盒来检测黄栌枯萎病菌的方法。本发明可以高灵敏度、高准确度快速地检测黄栌枯萎病菌。

技术领域

本发明属于园林植物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种用于检测黄栌枯萎病菌的检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

黄栌(Cotinus coggygria)，又名黄道栌或红叶，漆树科黄栌属植物；落叶灌木或小乔木，株高3米至5米，秋季经霜后叶色艳红，是极具观赏价值和经济价值的树种，作为北京香山公园的主要红叶树种，吸引着大量的中外游客，在红叶文化的传承中具有不可替代的作用。

但是，自上世纪80年代以来，因感染大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，北京、山东等地黄栌出现了大面积枯死现象，其中北京香山公园黄栌林因枯萎病出现了大面积枯死现象，每年枯死的黄栌一度达到数千株，园内黄栌枯萎病发病率高达46.2％，严重影响了香山的红叶景观。目前黄栌枯萎病已成为为害黄栌的一种毁灭性病害，是北京城市园林生态系统建设中函待解决的难题之一。

多年来北京林业大学及香山公园对黄栌枯萎病的致病菌、发病因子、药剂防治方法等进行了深入研究，但仍未有效控制黄栌枯萎病的发生(宋立洲，杜万光，李维维.2011.香山公园黄栌枯萎病防治技术研究.北京园林，27(2):51-56；葛雨萱，周肖红，刘洋，等.2014.黄栌属种质资源、栽培繁殖、化学成分、叶色调控研究进展.园艺学报，41(9):1833-1845；雷增普.1993.北京地区黄栌黄萎病病原菌的研究.北京林业大学学报，15(3):88-93)，主要原因之一是大丽轮枝菌的已知寄主植物超过200种，许多园林植物及林下杂草都是其无症状带菌体，这些植物虽然体内含有大丽轮枝菌，但本身并不表现任何症状，成为黄栌枯萎病传播的重要介体(Inderbitzin，P.，and Subbarao，K.V.2014.Verticilliumsystematics and evolution:How confusion impedes Verticillium wilt managementand how to resolve it.Phytopathology，104:564-574；王正芬.棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)的寄主种类鉴定.西北农业大学学报，1987，15(1)：35-48)。传统的病原物分离、鉴定技术费时费力，难以对大量苗木进行快速检测。因此，探求有效、快速的黄栌枯萎病菌(Verticillium dahliae)的检测技术对黄栌枯萎病的防治具有重要的生产实践意义。

PCR技术的发展推动了植物病害诊断和病原菌鉴定工作，朱有勇等(1999)根据棉花黄萎病菌(Verticillium dahlia)核糖体基因ITS区段的碱基编码序列，设计了一对26bp的PCR特异性扩增引物用于棉花黄萎病菌的分子鉴定和分子监测，但不能区分不同致病类型。Encarnacion等(2000)选用17株棉花黄萎病菌和5株油橄榄黄萎病菌(Verticilliumdahlia)落叶型菌株，以及18株棉花黄萎病菌和7株油橄榄黄萎病菌非落叶型菌株，利用RAPD-PCR方法分别筛选到落叶型黄萎病菌和非落叶型黄萎病菌的特征性条带，对该特异性条带进行测序，并进行Blast比对，无相似性片段报道。但是，在生产实际中，由于土壤理化性质和生态系统的复杂性，土壤中的棉花黄萎病菌所占比例很低，通过常规PCR方法很难检测到其存在。另外，由于植物基因组序列的不同和病原菌的快速变异，现有检测技术不适合进行大丽轮枝菌的快速检测。

因此，针对以上不足以及黄栌枯萎病治理的紧急需要，迫切需要一种能够快速、灵敏、准确地检测黄栌枯萎病菌的方法。

发明内容